[发明专利]一种提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡萄糖脱氢酶（Glucose dehydrogenase，缩写GlcDH）是短链乙醇脱氢酶中的一种，在辅酶NAD(P)+等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸，葡萄糖脱氢酶可以广泛的应用于食品工业及医药工业领域。葡萄糖脱氢酶广泛存在于多种微生物和组织中，在生物合成途径中，葡萄糖脱氢酶是其限速酶，作为一种氧化还原酶，葡萄糖脱氢酶可制成生物传感器。葡萄糖脱氢酶还对D-核糖合成和手性醇生产起重要作用。另外还可以作为临床血糖测定的诊断用酶。目前，我国绝大部分诊断用酶都依赖进口，葡萄糖脱氢酶也不例外。因此，近年来葡萄糖脱氢酶的自主开发也成为国内许多科研工作者关注的焦点。

葡萄糖脱氢酶主要从动物的肝脏提取或由芽孢杆菌发酵而来，但来源受到一定的限制，现有技术中也有采用表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌进行活化、培养和发酵诱导过程，得到相应的大肠杆菌发酵液，再采用常规方法从发酵液中提取葡萄糖脱氢酶。如中国专利申请（公开号：CN102604904A）公开的一种葡萄糖脱氢酶的生产方法，即先构建表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌接种至初始培养基中进行发酵，发酵过程中通过添加补料培养基，当发酵参数达到设定阈值时，再向发酵液中添加诱导剂，并继续发酵一定时间至发酵结束；最后，从发酵液的培养物中提取葡萄糖脱氢酶。其虽然公开了一种利用重组大肠杆菌生产葡萄糖脱氢酶的方法，但由于葡萄糖脱氢酶是一种胞内酶，需要对细胞进行破碎才能获得。

目前，国内大多采用反复冻融法、匀浆法或超声破碎法，而国外则有人采用先进的高压细胞破碎仪进行破碎处理。但目前，采用反复冻融法和破碎法主要应用于实验室规模的细胞破碎，一般处理量小，很难适应大规模生产的需要，而匀浆法虽然能适应大规模生产，但其破碎强度偏高，容易破坏葡萄糖脱氢酶的活性，降低了葡萄糖脱氢酶的活性；而若将破碎强度降低，则细胞释放葡萄糖脱氢酶不完全。因此，现在的均无法保证葡萄糖脱氢酶活性和高释放量的统一性。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一种提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法，解决现有的因破碎强度高而破坏葡萄糖脱氢酶活性的问题，实现具有高释放量和酶活性高的效果。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法，该方法包括以下步骤：

A、选取用于生产葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌液，再加入非离子型表面活性剂，控制温度在20℃～45℃的条件下进行处理；

B、经过非离子型表面活性剂处理后，再用均质机在500～700MPa压力的条件下进行破碎细胞处理，得到含葡萄糖脱氢酶的细胞破碎液。

本发明的提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法，所述的用于生产葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌液，采用本领域常规的方法得到即可，如采用中国专利申请（公开号：CN102604904A），本发明为了解决现有的因采用高强度的破碎条件下，即当破碎压力超过700MPa时，对葡萄糖脱氢酶容易产生破坏的问题，通过先向用于生产葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌菌液中加入非离子表面活性剂进行处理，所述非离子表面活性剂具有亲水基团和疏水基团，当非离子表面活性剂靠近细胞膜，其疏水基团与细胞膜中磷脂的疏水基团结合形成疏水键，从而增加了磷脂的水溶性，使磷脂更易于溶解，从而破坏细胞膜，有利于促使细胞内的可溶物释放出来，再结合在500～700MPa压力的条件下进行破碎细胞处理，能够使葡萄糖脱氢酶的释放量大大得到提高，释放量能够提高1倍多，且由于破碎强度降低，也保证了葡萄糖脱氢酶的活性，从而实现提高葡萄糖脱氢酶释放量和保证酶活性的效果。

在上述的提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法中，作为优选，步骤A所述的非离子型表面活性剂选自吐温40、吐温20、吐温80或曲拉通X-100。所述曲拉通X-100的化学名称为辛基苯基聚氧乙烯醚。

在上述的提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法中，作为优选，步骤A中所述非离子型表面活性剂为曲拉通X-100，且所述曲拉通X-100的质量浓度为0.5%～5.0%。进一步的优选，所述曲拉通X-100的质量浓度为1.5%～2.5%。

在上述的提高葡萄糖脱氢酶释放量的方法中，作为优选，步骤A中所述处理的温度为25℃～37℃，优选为28℃～32℃。由于温度升高，细菌细胞膨胀，同时处理体系中分子运动加剧，更有利于曲拉通X-100与磷脂的相互作用，然而当温度过高时，又会导致酶失活，因此控制温度是必要。进一步的优选，步骤B所述处理的时间为10～30分钟。