[发明专利]一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种虾青素合成基因重组表达质粒pET-Ast，其特征在于所述重组表达质粒携带crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtS基因和crtR基因，该重组质粒的结构如图1所示 。

2.根据权利要求1所述的虾青素合成基因重组表达质粒pET-Ast，其特征在于所处重组表达质粒pET-Ast的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。 

3.一种虾青素合成基因重组表达质粒pET-Ast的制备方法，其特征包括如下步骤： 

Ⅰ）基因扩增： 

提取Pantoea agglomerans ACCC10495的基因组DNA，采用PCR扩增crtE、crtB、crtI、crtY基因编码框，相应引物分别为P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8： 

所述P1的碱基序列为5’-CAGCATATGATGGTGAGTGGCAGT-3’ 

所述P2的碱基序列为5’-TTAATTGTTAACTCAGGCGATTTTCAT-3’ 

所述P3的碱基序列为5’-TTAATTGTTAACATGAGCCAACCGCCG-3’ 

所述P4的碱基序列为5’-GGGCCCCAATTGCTAAACGGGACGCTG-3’ 

所述P5的碱基序列为5’-GGGCCCCAATTGATGAAAAAAACCGTT-3’ 

所述P6的碱基序列为5’-GGAATTCGCTAGCGAATTTCAGGCTGGCGGTGG-3’ 

所述P7的碱基序列为5’-GGAATTCGCTAGCGAATTGTGAGGGATCTGATT-3’ 

所述P8的碱基序列为5’-CCCTTTAAAGGGTCATCCTTTATCTCG-3’； 

选用RNA提取试剂盒提取Phaffia rhodozyma CGMCC2.1557的总RNA，以HiFi-MMLV  cDNA第一链合成试剂盒逆转录得cDNA第一链，采用RT-PCR扩增crtS、crtR基因编码区，相应引物为P9/P10、P11/P12： 

所述P9的碱基序列为5’-CCCTTTAAAGGGATGTTCATCTTGGTC-3’ 

所述P10的碱基序列为5’-CTAGTGCACTAGTCATTCGACCGGCTT-3’ 

所述P11的碱基序列为5’-CTAGTGCACTAGATGGCCACACTCTCCGAT-3’ 

所述P12的碱基序列为5’-ATTGCGGCCGCCTACGACCAGACGTCCATC-3’； 

Ⅱ）构建克隆质粒： 

将crtE、crtB、crtI、crtY、crtS、crtR的扩增产物分别进行1.5%凝胶电泳，然后分别回收924bp、930bp、1459bp、1161bp、1674bp、2825bp处的条带，然后分别与克隆载体pMD18-T连接、转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆,发酵后提取得到pMD18-crtE、pMD18-crtB、pMD18-crtI、pMD18-crtY、pMD18-crtS和pMD18-crtR克隆质粒； 

Ⅲ）构建重组表达质粒pET-Ast： 

阳性克隆质粒分别进行双酶切，验证基因序列与载体连接的方向：pMD18-crtE以Nde Ⅰ和EcoRⅠ双酶切；pMD18-crtB以HpaⅠ和EcoRⅠ双酶切；pMD18-crtI以MfeⅠ和EcoR Ⅰ双酶切；pMD18-crtY以NheⅠ和EcoRⅠ双酶切；pMD18-crtS以AhaⅢ和EcoRⅠ双酶切；pMD18-crtR以ApaLⅠ和EcoRⅠ双酶切，选取基因序列与pMD18-T反向连接的克隆质粒； 

将筛选得到的pMD18-crtE和pMD18-crtB经HpaⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接得pMD18-crtEB；将酶切连接得到的pMD18-crtEB和pMD18-crtI经MfeⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接得pMD18-crtEBI；将酶切连接得到的pMD18-crtEBI和pMD18-crtY经NheⅠ和EcoRⅠ双酶切连接得pMD18-crtEBIY；将酶切连接得到的pMD18-crtEBIY和pMD18-crtS经AhaⅢ和EcoRⅠ双酶切连接得pMD18-crtEBIYS；将酶切连接得到的pMD18-crtEBIYS和pMD18-crtR经ApaLⅠ和EcoRⅠ双酶切连接得pMD18-crtEBIYSR； 

将表达载体pET-28a经SnaⅠ和BglⅡ酶切，将切口补平连接得载体pET-28a-SB； 

将质粒pMD18-crtEBIYSR和载体pET-28a-SB经NdeⅠ和NotⅠ双酶切，酶切产物连接、转化大肠杆菌DH5α，得到重组表达质粒pET-Ast。