[发明专利]一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及重组质粒及其制备方法和用途，具体的说是一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途。

背景技术

虾青素是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素。近年来的药理学和生理学研究发现虾青素具有极强的生物抗氧化性,此外,还具有促进抗体产生、增强免疫力以及抗紫外线辐射等作用,因而在医药、食品、水产业、化妆品等方面有着广阔的应用前景。目前,虾青素的生产方法主要有化学合成法、虾壳类提取、生物技术法。由于化学合成工艺复杂,而虾壳类废弃物中虾青素的含量低,因此化学合成法、虾壳类提取法的生产成本均比较高。生物技术法通常是利用红发夫酵母和雨生红球藻生产虾青素,现有研究大量集中在高产菌株的选育、廉价培养基的利用、培养条件的优化等方面。不过传统菌种选育方法（如：原生质体融合,物理诱变、化学诱变等方法虽然易操作,并可在一定程度上提高细胞内的虾青素含量,但随机性大,方向性差。近年来，通过使用特异性抑制剂，红球藻中虾青素的生物合成途径已基本清楚，其合成途径通常是由丙酮酸盐(pyruvate)和3一磷酸甘油醛(glyceraldehyde，3-P)从头合成，先形成五碳的异戊烯焦磷酸(Isopentenypyrophosphate，IPP)，再转化成同分异构体的二甲基丙烯焦磷酸(dimethylallylpyrophospbate，DMAPP)。由三分子的DMAPP和一分子的IPP(isopenteny pyrophosphate)经三步缩合反应形成廿碳的GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)。在八氢番茄红素合成酶(crtB>的作用下，2分子的GGPP缩合形成四十碳的八氢番茄红素(phytoene)。八氢番茄红素在八氢番茄红素去饱和酶（crtI）和‘一胡萝卜素去饱和酶(ZDS)的催化下，经4步脱氢去饱和反应形成番茄红素(1ycopene)，番茄红素在番茄红素B环化酶（crtY）的作用下，进一步环化后形成B一胡萝卜素。B一胡萝卜素c3’和C4’分别经过羟基化和酮基化最终形成虾青素。B一胡萝卜素可以先在C一3，3’位羟基化形成中间产物B～隐黄质(B-Cryptoxanthin)和玉米黄素，再在C-4位氧化形成中问产物3一二羟基一2一酮一B一胡萝卜素(Adonixanthin)，进一步氧化Adonixanthin最后形成虾青素。9一胡萝卜素也可以先在c-4，4’氧化形成中间产物海胆酮(Echinenone)和角黄质，再在C-3位羟基化形成中间产物4_二酮一3一羟基一B一胡萝卜素(Adonimbuin)，进一步将Adonimbuin在C一3’位羟基化形成虾青素。其中B一胡萝卜素酮化酶(Crt再或CrtO)和B一胡萝卜素羟化酶(CrtZ)分别控制B一胡萝卜素的酮基化和羟基化过程。目前编码虾青素合成路线中的27种不同的酶的150多个基因已经从细菌、植物、藻类和真菌的细胞中克隆出来，因此通过构建虾青素生物代谢工程合成虾青素逐渐受到研究人员的青睐。目前虾青素生物代谢工程或是是对将外源虾青素合成基因导入本身不合成虾青素的受体,以形成虾青素合成酶的高效表达，或是通过对本身可以合成虾青素的雨生红球藻或红发夫酵母等为代谢工程的受体,通过改变虾青素合成酶的数量、活力以及调控机制,实现虾青素的高效表达。由于虾青素在微生物体内的合成步骤多且复杂，因此研制能够高效表达虾青素多种合成酶的载体成为人们研究的热点和难点。另外，研究人员对研发过程中目标受体虾青素合成代谢途径中主要酶系的功能的检测也存在很多困惑，如通过离体的生化反应或利用基因突变株进行功能互补的方法进行检测，其操作步骤比较繁琐，并且效率也不高。因此如何获得一种高效检测目标受体虾青素合成酶活性的方法亦是本领域研究人员所关注的问题。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一种高效表达虾青素多种合成酶的重组质粒，以期能够准确、快速构建出虾青素生产菌株；本发明的目的之二就是提供该重组质粒的一种制备方法；本发明的目的之三就是提供一种该重组质粒的用途，即所述重组质粒在检测虾青素合成主要相关基因的功能中的应用，更具体地说是虾青素合成基因重组表达质粒pET-Ast在检测目标受体虾青素合成酶活性中的应用。

本发明的目的是按如下的技术方案实现的：

本发明所提供的虾青素合成基因重组表达质粒pET-Ast，其携带有crtE基因、crtB基因、crtI基因、crtY基因、crtS基因和crtR基因，该重组表达质粒的结构如图1所示；