[发明专利]一种表达耐酸高温α-淀粉酶基因突变体的工程菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达耐酸性高温α-淀粉酶基因的工程菌株。具体说是通过化学诱变剂对高温α-淀粉酶基因amy进行突变，再通过酸性条件筛选获得新型耐酸高温α-淀粉酶基因突变体amyM，在地衣芽孢杆菌工程菌中实现表达和应用。

背景技术

高温α-淀粉酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a-1，4葡萄糖苷键的α-淀粉酶，因为其最适反应温度较高，一般为60摄氏度以上，因此称为高温α-淀粉酶。

高温α-淀粉酶广泛应用于酒类、味精及淀粉糖等工业生产，代替传统工艺既省工省厂房设备，又能提高出品率，降低成本，增加效益。地衣杆菌α-淀粉酶是我国产量最大用途最广的一种高效液化型淀粉酶，它是由耐热性能高的地衣杆菌诱变后逐级扩大培养再经提纯而获得的一种酶制剂，主要作用是能将原料中的淀粉质液化为糊精。

目前，国内外市场中常用的淀粉酶的最适pH值在6.0～10.0，在酸性条件下，其酶活性降低很明显，甚至失去活性。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展，工艺条件的不断改变，一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的pH值条件下进行。所以，开发新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫。

由于从自然界筛选得到的野生菌株产酸性α-淀粉酶的活力一般都比较低，不能直接运用于工业化的发酵生产。国内外学者一般通过对野生菌株的诱变、杂交育种等技术手段，来提高菌株的产酶能力，戚薇等通过利用低能N⁺注入枯草芽孢杆菌，诱变后得到的菌株，其酸性α-淀粉酶的酶活为343U／ml，通过诱变后，与出发菌株相比较，最适作用pH值偏低一个单位(戚薇，王海燕，王建玲，等.氮离子注入选育耐酸性α2淀粉酶产生菌诱变效应的研究。天津科技大学学报，2007，22(9)：7-8.)。随着分子生物学的迅速发展，基因工程育种技术由于可以对基因进行预先设计和控制，并且表达作用效果明显，所以越来越受到国内外研究者的青睐。蔡恒等把α-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭质粒pBE2中，构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外，分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性(蔡恒，陈忠军，李金霞，等。α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。食品与发酵工业，2005，31(10)：33-36.)；欧洲研究者采用基因改造Bacillus licheniformis来生产耐热性的酸性α-淀粉酶，在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸用其他任何一种氨基酸代替，使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产的α-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100～110℃时活性不变(SHAW A,BOTT R,DAY A G.Protein engineering ofα-amylase for low pH performance.Curr Opin Biotechnol，1999(10)：349-352.)。

我国是农业大国，淀粉资源非常丰富，酸性淀粉酶的应用范围也越来越广泛。早在20世纪70年代，国内就有学者对酸性淀粉酶开始了研究，取得了一些研究成果，但与国外相比，差距甚远，我国产酸性α-淀粉酶的菌株较单一，且酶活较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达耐酸性高温α-淀粉酶的基因工程菌株。

本发明所提供的可表达高温α-淀粉酶的工程菌，是将来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)高温α-淀粉酶基因进行突变，得到突变体，然后把表达耐酸性高温α-淀粉酶基因突变体重组载体导入地衣芽孢杆菌中，筛选得到的高温α-淀粉酶耐酸性提高的工程菌株；所述高温α-淀粉酶氨基酸序列如序列表1所示；所述耐酸性高温α-淀粉酶突变体氨基酸序列如序列表2所示。

所述地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis)为地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis)CICC10181。所述可表达耐酸性高温α-淀粉酶的工程菌优选为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformi5)ZHWY CGMCC No.6669。

所述地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ZHWY CGMCC No.6669，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.6669。