[发明专利]一种菌根化石斛苗茶树仿野生栽培方法

权利要求书

1.一种菌根化石斛苗茶树仿野生栽培方法，其特征包括以下步骤： 

步骤1：菌根真菌的发酵培养 

A.选取野生石斛的新鲜营养根，将根段浸入1％次氯酸钙溶液中1-10min进行表面灭菌，然后用无菌水冲洗3-5次；将根段切成0.5-3mm长的小段，放置在分离培养基上，20-30℃下暗培养，待菌丝自根段中长成菌落后，挑取菌丝在分离培养基上进行培养纯化后转接于固体发酵培养基中，于2-30℃恒温培养5-50天后在菌落边缘打孔成菌片，直接使用或作为菌根真菌种子菌种进一步接入液体或固体发酵培养基进行放大培养； 

所述的分离培养基为：葡萄糖1-30g／L、蛋白胨1-10g／L、链霉素0.001-1g／L、研磨过的缺齿蓑藓1-30g／L、干酪素水解物0.01-10g/L、琼脂1-30gg／L，pH值4-9； 

所述的发酵培养基为：马铃薯20-300g／L、葡萄糖2-300g／L、缺齿蓑藓研磨物20-300g／L、蛋白胨1-30g/L、硫酸铵0.1-20g/L、磷酸二氢钾0.1-20g／L、硫酸镁0.1-20g／L、氯化锰0.1-20g／L，琼脂1-30g／L，pH值4-9； 

B.液体发酵培养 

将菌根真菌种子菌种接入发酵培养基用三角瓶或其他容器振荡或发酵罐通气暗培养，培养结束后直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；发酵条件为：接种量6％-18％，温度20-30℃，培养时间5-90h； 

C.固体发酵培养 

将菌根真菌种子菌种接种至固体发酵培养基中，接种量6％-18％，温度20-30℃下发酵培养2-50天，待菌丝50％～100％长满培养基时获得菌根真菌固体菌块； 

步骤2：石斛组培苗的培养 

A.原球茎诱导及继代增殖培养：采集野生石斛属带腋芽的幼茎，用75％的酒精浸泡50±10秒后，再用浓度为1g／L的氯化汞溶液浸泡1-10分钟，无菌水冲洗3-5遍，切取0.1-3cm茎段接种到1／2MS+6-BA0.01-10mg／L+NAA0.01-10mg/L+研磨过的缺齿蓑藓1-200g／L+马铃薯汁1-200g／L+蔗糖2-20g／L的琼脂培养基上；pH为4-9，在20-30℃，光照强度为1500-2500Lx，光照12h／d，培养10-90天，腋芽处可抽生新枝呈丛芽状，新枝可切割重复培养，直至长成完整试管苗供移栽；或将诱导出的原球茎接种到继代增殖液体培养基和继代增殖固体培养基上交替培养，增殖培养10-60天为一个继代周期，培养温度20-30℃，光强度1500-4000Lx，光照10-14小时／天； 

所述继代增殖液体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg/L+马铃薯煮汁2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g／L+活性炭0.1-10g／L+蔗糖2-50g／L，pH4-9； 

所述继代增殖固体培养基为：1／2MS+6-BA0.1-10mg／L+NAA0.1-10mg／L+马铃薯汁2-200g／L+缺齿蓑藓研磨物1-200g／L+活性炭0.1-10g/L+蔗糖2-50g／L+琼脂1-30g／L，pH4-9； 

B.生根壮苗培养：当无根苗高2-3厘米时转接到壮苗生根培养基上培养；壮苗生根培养基为：1／2MS+NAA0.1-10mg／L+研磨过的缺齿蓑藓1-200g／L+香蕉匀浆20-200g／L+蔗糖5-50g／L+活性炭0.1-10g/L+琼脂3-30g／L；培养温度20-30℃，pH4-9，培养3-90天，此时光照加强至2500-4000Lx，光照10-14小时／天； 

步骤3：石斛苗与菌根真菌的共生栽培：在无菌条件下将根系正常的3-4叶组培苗接入菌根真菌固体菌块中共生培养1-90天，在自然条件下培养； 

步骤4：菌根化的石斛苗炼苗方法 

A.恒温下将试管苗在玻璃瓶中炼1-15天； 

B.将石斛小苗从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡3-10分钟后凉干，以浸泡杀菌处理过的泥炭藓和／或缺齿蓑藓为栽培基质，以(1／3-1／10)knop5-30g／L+蔗糖1-30g／L+酒石酸铵0.01-30g／L+菌根真菌发酵液5-100mL／L为共生栽培营养液，以小塑料盆为栽培容器分级炼苗，取3-5株为一丛，将根部栽入栽培基质中，炼苗采用温棚，温度控制在10-38℃，空气湿度为40％-85％，遮阴度50-70％，光照度1000-5000Lx，浇水采取喷淋法，炼苗时间1-12个月； 

步骤5：石斛组培苗与茶树附生栽培方法 

A.茶树的选择：选择位于自然遮光度在60％-80％，光照为散射光，光照强度在1000-5000Lx环境下的茶树树干； 

B.石斛伴苔藓贴树种植：在茶树近根部树干和茶树根周围直径1-20cm处涂一层苔藓混合物，厚度为0.1-10cm，培养5-20天后将小塑料盆中的石斛苗和苔藓基质一起移出绑牢在向阳面茶树枝干苔藓部位，使种苗根系贴紧树干苔藓，基质下部紧贴树干周围苔藓混合物涂层；一丛3至5株，每丛相距10厘米以上；石斛捆绑在茶树上后，连续7天用共生营养液对植株喷洒一次，润湿植株根系及附近苔藓； 

所述的苔藓混合物(w／w)由(1／3-1／10)knop5-30、糯米5-20、发酵动物粪便10-70、苔藓1-30、蔗糖1-10、酒石酸铵0.01-10、菌根真菌粉1-30； 

C.石斛的采收：栽种后1-2年即可采收，采收时根部留2-3cm长根头，剪老留嫩。