[发明专利]H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗。

背景技术

高致病性禽流感的广泛传播和相继的人类感染使我们认识到人类正面临由H5N1型禽流感病毒引起流感大流行的危险。已经有50多个国家从禽类中分离到高致病性H5N1禽流感病毒。首例H5N1人禽流感病例于1997年出现在香港，而基因组分析结果表明此株H5N1病毒的HA基因来源于1996年广东省鹅H5N1分离毒株；华南地区（特别是广东）四季特征不明显，是鸟类迁徙的中转地，几次流感大流行都发源于此，一直被认为是世界流感的发源地之一。

病毒样颗粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。病毒衣壳蛋白一般具有天然的自装配能力，并且VLPs没有感染性，稳定性好，不易失活，可以制备为良好的疫苗。利用基因工程的分子克隆、合成既具有病毒稳定的自然形态、又具有病毒完整的免疫原性、但又没有病毒任何的感染源性的病毒样颗粒VLP，要求同时具备病毒分子生物学、载体系统的结构生物学、生物工程和发酵工程等诸方面的知识、技术和工艺手段。因此，到目前为止，在病毒疫苗的研究领域，国际上仅有默克公司的用于预防子宫颈癌的人乳头瘤状病毒HPV的VLP疫苗上市。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用面包酵母高效生产高致病性H5N1禽流感病毒样颗粒及其应用和制备方法、疫苗。

本发明的一个技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：5。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒中，所述HA蛋白核苷酸序列为SEQ ID No:2，所述NA蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No:6。

本发明的另一技术方案为提供一种含有上述H5N1禽流感病毒样颗粒的疫苗。

优选的，上述的疫苗为固态制剂、肌注或喷雾型液态制剂。

本发明的另一技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒的用途，用于制备预防禽流感病毒相关疾病的组合物。

本发明的另一技术方案为提供一种H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆载体中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列为SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：6依次的组合，将克隆载体的禽流感病毒基因连入重组表达载体，将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述克隆载体为PVD5质粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述重组表达载为PTG3828质粒。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述酵母感受态细胞为C13BYS86。

优选的，上述的H5N1禽流感病毒样颗粒的制备方法中，所述步骤“将重组表达载体转入到酵母感受态细胞中进行发酵培养，培养后将培养物纯化即得H5N1禽流感病毒样颗粒”具体为：将重组表达载体转染酵母感受态细胞C13BYS86，经30℃，72小时震荡培养饱和培养后，进行1分钟超声波裂解，3000rpm高速离心除细胞碎片，收集上清即为液态免疫原的H5N1禽流感病毒样颗粒。

本发明有益效果：本发明利用酵母表达系统最嗜好的核苷酸密码子，大片段合成HA、NA、M2结构蛋白的基因，构建HA、NA、M2在酵母表达系统的重组表达载体，并经面包酵母工程菌转染，制备高致病型禽流感病毒样粒子。

附图说明

图1为H5N1禽流感病毒样颗粒的凝血因子HA蛋白、神经氨酸酶NA蛋白和细胞基质M2蛋白的基因表达构架；

图2为H5N1禽流感病毒样颗粒的克隆载体pVD5质粒基因表达构架；

图3为H5N1禽流感病毒样颗粒的表达载体PTG3828质粒基因表达构架；

图4为H5N1禽流感病毒样颗粒的电子显微镜照片；