[发明专利]一种高效制备重组人MICA蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体地涉及毕赤酵母生产重组人MICA蛋白的方法。 

背景技术

MICA是mic基因家族的一个成员，位于6号染色体距离HLA-B基因座着丝粒端约46.5kb处，属于非经典的HLA-1类基因。正常生理条件下，其编码的蛋白存在于细胞表面，且被高度N-糖基化修饰。区别于经典的MHC I类分子，MICA不与beta-2-微球蛋白结合形成异二聚体。作为NKG2D的受体，MICA被认为直接参与了NK细胞介导的杀伤肿瘤功能。此外，Bauer等证实MICA作为NKG2D的配体在器官移植所引起的免疫反应方面也发挥着重要的作用(Bauer,S.,V.Groh等(1999).Activation of NK cells and T cells by NKG2D,a receptor for stress-inducible MICA.Science285(5428):727-729)。 

本发明前，市场上出售的重组人MICA主要是用大肠杆菌和人的细胞系进行重组表达的。众所周知，现有的大肠杆菌系统不具备对重组表达的蛋白进行翻译后修饰，特别是N-糖基修饰。在大肠杆菌中重组表达的蛋白多以包涵体的形式存在，涉及复杂的变复性过程，且整个系统会产生大量的内毒素等诸多不利因素。人的细胞系等动物细胞表达系统通常需要消耗大量的血清而大大增加了生产成本，且生产周期和生产设备要求高，但产量却很有限。值得注意的是，有很多的研究显示了动物细胞系统所生产的蛋白产品具有潜在的病毒污染风险。此外，曹利平等公开了一项MICA蛋白的制备方法专利(CN102154302A)，他用重组的杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞来重组表达和制备MICA蛋白。由于该方法采用了杆状病毒系统，有直接的病毒污染的可能性，不符合目前关于临床注射用治疗性蛋白的标准。同时，Sf9昆虫表达系统具有一般动物细胞表达系统所含有的缺 点。 

尽管毕赤酵母被广泛用于尝试表达各种人来源的重组蛋白，但是由于不同的蛋白本身具有复杂性和特殊性，因而最终的表达和制备效果是无法预测的。同时，成功地利用毕赤酵母来重组表达和制备MICA蛋白目前还没有报道。 

综上，当前急需要一种简便，活性高，产量高和有产业化应用前景的重组人MICA蛋白的制备方法。 

发明内容

本发明的技术方案 

本发明提供了一种利用毕赤酵母表达和制备重组人MICA蛋白的方法。 

本发明的方案-1提供了在毕赤酵母中利用甲醇诱导表达重组人MICA蛋白的方法，其包括了重组表达质粒的构建、甲醇诱导重组蛋白的表达和重组蛋白的纯化方法。 

本发明的方案-2提供了在毕赤酵母中利用组成型表达(非甲醇诱导)重组人MICA蛋白的方法，其包括了重组表达质粒的构建、重组蛋白表达和重组蛋白的纯化方法。 

具体而言，方案-1和方案-2都包含以下步骤： 

(1)构建组成型表达载体，其包含启动子、终止子、抗生素抗性基因、分泌信号肽和MICA的编码序列； 

(2)电转毕赤酵母，利用抗生素浓度梯度来筛选高效表达克隆； 

(3)MICA蛋白的表达和纯化； 

在本发明的一方面中，所用的分泌信号肽为α-factor的Pre序列(SEQ ID No:1)，而非完整的α-factor Pre-Pro序列(SEQ ID No:2)。 

在本发明的另一方面中，所用的MICA的编码序列是未经密码子优化的序列。 

在本发明的另一方面中，所用的MICA的编码序列是经密码子优化的序列。对编码序列进行密码子优化以利于在宿主细胞中表达的方法是本领域技术人员熟知的。 

在本发明的另一方面中，所表达的MICA蛋白的C末端不带有6×His标签。 

在本发明的另一方面中，所表达的MICA蛋白的C末端带有6×His标签。 

在本发明的方案-1的一个方面中，所构建的甲醇诱导MICA表达载体包含的启动子为AOX1转录启动子，终止子为AOX1转录终止子，抗性基因为Zeocin抗性基因，分泌信号肽为α-factor的Pre序列，MICA的编码序列为人MICA(AAH16929.1)胞外区编码序列(Glu24-Gln308)。