[发明专利]抗CD24单克隆抗体、其可变区序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能特异性结合人白细胞分化抗原CD24的单克隆抗体、其可变区序列及其应用。

背景技术

人白细胞分化抗原CD24(cluster of differentiation 24)是一种新近发现并重点研究的肿瘤标志物。

当前研究表明，CD24分子是表观分子量介于30～70kDa之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。CD24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的O-或N-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)锚定在细胞膜的表面。

在生理情况下，CD24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的CD24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。

P选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，CD24是其配体之一。CD24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，CD24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。研究进一步发现，CD24表达与肝癌细胞的干性紧密相关，CD24可能成为一种新的肝癌干细胞表面标志物。

由此可见，CD24有望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。

发明内容

本发明目的一在于提供一种抗CD24单克隆抗体制备方法。

本发明目的二在于提供了一种抗CD24单克隆抗体。

本发明目的三在于提供抗CD24单克隆抗体的可变区氨基酸序列。

本发明以CD24核心区多肽与血蓝蛋白KLH偶联物(CD24-KLH)作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。

本发明克隆的抗体重链、轻链可变区氨基酸序列及其高变区如有SEQ ID No.1～16所示。

本发明的单克隆抗体可与CD24特异性结合。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测Protein G亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1为腹水样品；泳道2为上样收集液；泳道3为20mM磷酸钠缓冲液洗柱收集液；泳道4～6为100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)洗脱收集液(每分钟收集1 ml，共收集3ml)，泳道7～10为100mM甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱收集液(每分钟收集1ml，共收集4ml)。

图2为Western Blot鉴定纯化后抗体与CD24之间相互作用。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1市售CD24-Fc(购自北京义翘神州)；泳道2为市售Fc(购自北京义翘神州)。

图3为PCR扩增抗体重轻链可变区基因琼脂糖电泳结果。泳道M为标准分子量DNA；泳道1为PCR扩增抗体重链可变区基因产物；泳道2为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。

图4为竞争性ELISA测定单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4亲和力。

具体实施方式

实施例1抗CD24单克隆抗体杂交瘤细胞的制备

1.免疫原

CD24核心区由33个氨基酸残基组成，其分子量约为3.2kD，免疫原性较弱。本发明将抗原肽CD24与血蓝蛋白KLH偶联，以偶联物CD24-KLH作为免疫原，增强了CD24核心区多肽的免疫原性。本发明所用CD24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，纯度＞90％。

2.免疫动物

本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，为SPF级别，由扬州大学比较医学院提供。免疫佐剂为QuickAntibody，购自北京康碧泉公司。免疫流程参照QuickAntibody说明书进行，具体如表1所示。

表1.免疫途径与周期

3.细胞融合

1)细胞准备