[发明专利]一种分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr，其特征在于：其碱基序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述的分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）、根据pPIC9分泌型表达质粒和pAO815组成型多拷贝表达质粒的核酸序列，设计合成引物，所合成的引物如下：

引物名称引物序列

Cla I-F5′-GCATCGATAAGCTGACTCATGTTGG-3′

BER5′-GGAATCTTGGAATAGCCATCTCGTTTCGAATAATTAGTTG-3′

BEF5′-CAACTAATTATTCGAAACGAGATGGCTATTCCAAGATTCC-3′

BamH I-R5′-CGGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3′

（2）、以质粒pAO815为模板，使用引物Cla I-F与BER，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区的上游基因片段，上游基因片段为质粒pAO815中酶切位点Cla I起始并包括5′AOX启动子区在内的基因片段（1027bp）；

（3）、以质粒pPIC9为模板，使用引物BEF与BamH I-R，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区的下游基因片段，下游基因片段为质粒pPIC9中信号肽基因序列起始的包括多克隆位点在内的基因片段（722bp），并于3′端引入酶切位点BamH I，同时除去质粒pPIC9中信号肽基因序列上游的BamH I位点；

（4）、以步骤（2）和步骤（3）中合成的上游基因片段和上游基因片段为模板，使用引物Cla I-F与BamH I-R，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区（1719bp），该核心区基因序列5′端和3′端分别具有Cla I和BamH I酶切位点，且具有5′AOX启动子区，信号肽基因序列和多克隆位点区，并除去了信号肽基因序列5′端的BamH I位点；

（5）、将质粒pAO815与分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区分别经Cla I与BamH I双酶切后，纯化回收目的产物并连接，将连接后的产物转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，筛选出携带质粒pAO815Hr的阳性克隆菌株，并将其命名为pAO815Hr-DH5α。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中PCR反应程序为：95℃5min；循环30次：95℃30sec，55℃30sec，72℃1min30sec；72℃10min。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中PCR反应程序为：95℃5min；循环30次：95℃30sec，62℃30sec，72℃1min；72℃10min。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中PCR反应程序为：95℃5min；循环10次：95℃30sec，60℃30sec（每个循环下降0.5℃），72C2min；循环30次：95℃30sec，55℃30sec，72℃2min；72℃10min。

6.一种木聚糖酶DSB基因单拷贝重组质粒pAO815Hr-DSB，其特征在于：该重组质粒采用如下方法构建：将权利要求1中所述质粒pAO815Hr与木聚糖酶DSB基因分别经EcoR I和Not I双酶切后，回收目标产物并连接，连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，筛选携带木聚糖酶DSB基因的阳性克隆菌株并将其命名为pAO815Hr-DSB-DH5α。

7.一种木聚糖酶DSB基因双拷贝重组质粒pAO815Hr-2×DSB，其特征在于：该重组质粒采用如下方法构建：将权利要求6中的质粒pAO815Hr-DSB逐步经Bgl II和BamH I酶切并回收最终目标产物，将最终目标产物与质粒pAO815Hr-DSB经BamH I酶切后的回收产物进行连接，将连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态细胞，筛选单菌落进行液体培养，提取重组菌株中的质粒，采用Cal I和Bam H I进行双酶切验证，从中筛选出携带两个聚糖酶DSB基因且基因顺序一致的阳性克隆菌株并将其命名为pAO815Hr-2×DSB-DH5α。