[发明专利]一种分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明提供了一种分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr，以及其构建方法，特别是体外构建分泌型多拷贝工程质粒的方法，并能够认为操纵外源基因插入的拷贝数，有利于外源基因在毕赤酵母中高效表达的改造，本发明属于基因工程领域。

背景技术

甲醇酵母表达系统是一类最近发展十分迅速的外源蛋白质生产工具，同时具备原核生物的生长快，易于操作等特点和真核生物的翻译后修饰的功能，毕赤酵母表达系统是近10年来得到广泛应用的表达外源基因最成功的系统之一，使用最为广泛，有许多蛋白质和多肽在该系统中成功表达并且获得较高的表达量。

毕赤酵母酵母表达系统的质粒分为胞内表达和分泌表达两种，其中分泌性表达的质粒具有表达量较高、糖基化完全、高级结构形成正确、后续分离纯化程序比较简单的优点，因而使用更普遍。影响工程菌表达量的因素有很多，外源性因素如培养基成份、酸碱度和培养温度、通气量等，内源性的影响因素主要是目的基因特性和数量，虽然研究表明，基因的数量与表达量之间没有必然的联系，很少数的试验发现增加基因的数量表达量反而降低，但更多试验证实，相当数量的目的基因可以提高表达量。

质粒pPIC9和pAO815是Invitrogen公司开发的应用于毕赤酵母表达系统的整合型质粒，各有其特点，适合不同的外源基因表达策略。质粒pAO815适合体外构建多拷贝，但质粒上不含编码分泌信号肽的基因序列，属于胞内表达质粒，克隆位点仅有一个限制性酶EcoR I位点，对一些要求特殊的外源基因或特异克隆表达策略，会造成不便。质粒pPIC9携带分泌信号肽的基因序列，却不能于体外构建目的基因的多拷贝。

为了提高目的蛋白的表达量和避免质粒pAO815胞内表达、克隆位点单一的不足，利用质粒pPIC9分泌型质粒具有α-factor信号肽基因序列和多克隆位点的特点，可采用基因工程技术于体外对两者进行改造，实现外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的高效表达。

发明内容

本发明解决了背景技术中的不足，提供了一种分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr，用于在毕赤酵母中分泌表达外源基因。

本发明还提供了一种采用该重组表达质粒构建多拷贝外源基因重组质粒时的筛选验证方法。

本发明中所提供的分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr的制备方法如下：（1）、根据pPIC9分泌型表达质粒和pAO815组成型多拷贝表达质粒的核酸序列，设计合成引物，所合成的引物如下：

引物名称引物序列

Cla I-F5′-GCATCGATAAGCTGACTCATGTTGG-3′

BER5′-GGAATCTTGGAATAGCCATCTCGTTTCGAATAATTAGTTG-3′

BEF5′-CAACTAATTATTCGAAACGAGATGGCTATTCCAAGATTCC-3′

BamH I-R5′-CGGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3′

（2）、以质粒pAO815为模板，使用引物Cla I-F与BER，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区的上游基因片段，上游基因片段为质粒pAO815中酶切位点Cla I起始并包括5′AOX启动子区在内的基因片段（1027bp）；

（3）、以质粒pPIC9为模板，使用引物BEF与BamH I-R，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区的下游基因片段，下游基因片段为质粒pPIC9中信号肽基因序列起始的包括多克隆位点在内的基因片段（722bp），并于3′端引入酶切位点BamH I，同时除去质粒pPIC9中信号肽基因序列上游的BamH I位点；

（4）、以步骤（2）和步骤（3）中合成的上游基因片段和上游基因片段为模板，使用引物Cla I-F与BamH I-R，采用PCR反应合成分泌型多拷贝重组表达质粒pAO815Hr核心区（1719bp），该核心区基因序列5′端和3′端分别具有Cla I和BamH I酶切位点，且具有5′AOX启动子区，信号肽基因序列和多克隆位点区，并除去了信号肽基因序列5′端的BamH I位点；