[发明专利]快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白的方法及对其是否与AFB₁具有结合性的体外验证分析。

背景技术

真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物有极大危害。历年来有大量关于真菌毒素污染粮食和作物，导致事物中毒事件的报道，其中常见到的真菌毒素有：黄曲霉毒素、黄绿青霉素、橘青霉素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇等。其中，黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFT）是主要由黄曲霉 （aspergillus flavus）寄生曲霉 （Aspergillus parasiticus）产生的次生代谢产物，污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。黄曲霉毒素在 1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁, AFB₁）最为多见，危害性也最强。动物实验表明，AFB₁具有强肝脏毒性和致癌效应。

一直以来科学家围绕AFB₁的产毒机理、毒素的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子的特点，针对毒素被动物细胞吸收的机理研究很少。本发明设计了一种快速鉴定与AFB₁互作的蛋白的方法，本发明通过固相亲和层析法寻找出黄曲霉毒素的结合蛋白，利用该方法可以快速有效地找出与AFB₁互作的结合蛋白，为促进对该毒素的致毒机理的研究奠定基础。本方法包含，将AFB₁与载体蛋白进行偶联，将毒素与载体蛋白的偶联复合物固定在PVDF膜上，让偶联复合物与宿主的总蛋白孵育，进行非特异性洗涤和特异性洗脱并进行质谱鉴定。通过该方法得到的AFB₁的互作蛋白准确度高，能为毒素被动物细胞吸收机理的研究打下基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法，通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白的方法，及对其与AFB₁是否具有结合性的体外验证分析。经此方法的筛选和验证，目前已经发现40S核糖体蛋白SA和雌二醇β脱氢酶5能与AFB₁结合，是AFB₁的互作蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速鉴定与黄曲霉毒素B₁互作的宿主蛋白的方法，是先将黄曲霉毒素B₁与牛血清白蛋白进行偶联，再通过固相层析的方法，筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白，经质谱分析鉴定后，再通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性。

所述的通过固相层析的方法来筛选与黄曲霉毒素B₁结合的蛋白，是将牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁偶联复合物展示在甲醇活化后的PVDF膜上，3-5℃过夜孵育；将孵育了牛血清蛋白-黄曲霉毒素B₁的PVDF膜用质量分数为2% 牛血清蛋白溶液进行封闭后，将膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中3-5℃过夜孵育以充分结合，同时用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中作为阴性对照；再用3-5℃预冷的磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液进行非特异性洗脱，3-5℃振摇10min，洗涤四次，用2M的NaCl进行特异性洗脱，3-5℃振摇30min，洗脱液中的互作蛋白浓缩后进行SDS-PAGE分析，银染后取差异条带进行质谱分析鉴定。

所述的通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性，对经质谱鉴定的黄曲霉毒素B₁互作蛋白进行基因克隆、诱导表达、纯化后，通过ELISA的方法验证相应蛋白与黄曲霉毒素B₁的结合性；