[发明专利]一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是：

利用软件primer premier 5.0，根据鸡SLC45A2基因的DNA序列设计引物对M4-S/A，引物长度为22bp，引物序列为：M4-S：5'  ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT  3'，M4-A：5'  AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT  3'；

以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μL体系如下：1.5μL 10×EasyTaq Buffer(+Mg²⁺)，0.3μL 正反引物（10μM），0.15μL的dNTP（2.5mM），0.5U的Taq聚合酶，1μL的基因组DNA，加超纯水补齐至15μL；反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸5min，15℃，1min，4℃下保存备用；

电泳检测PCR产物：取 6 μL PCR产物，加3μL 6×Loading Buffer，制备浓度为1.2 %的琼脂糖凝胶，点样后，在120V电压下电泳40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功；

限制性内切酶酶切：酶切的反应体系为：超纯水3.6μL，10×bufferG 0.5μL，内切酶4U，PCR产物1μL，于37℃酶切16h；

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物：采用浓度为40%、交联度为19:1的聚丙烯酰胺，配制浓度为16%的聚丙烯酰胺凝胶，体系为：聚丙烯酰胺18 mL，5×TBE 9 mL，超纯水18 mL，10%AP 350μL，TEMED 35μL，先300V电泳10min，再120V电泳5.5h；

银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果：银染步骤如下：超纯水漂洗两遍，10%的无水乙醇漂洗10min；超纯水漂洗两遍，1%的硝酸漂洗10min；超纯水漂洗两遍，0.2%的硝酸银加750μL甲醛避光漂洗20min；超纯水漂洗两遍，3%的氢氧化钠加1mL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果；

在公鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽纯合子：Z^sZ^s；条带为64bp、55bp和16bp则为银羽杂合子：Z^SZ^s；条带为55bp和16bp则为银羽纯合子：Z^SZ^S；

在母鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽半合子：Z^sW；条带为55bp和16bp则为银羽半合子：Z^SW。