[发明专利]疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一组疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

（二）背景技术

普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸（Ⅰ），属γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物（Angew.Chem.Int.Ed.2008,47:3500-3504）。普瑞巴林是一种钙离子通道调节剂，能够有效抑制与神经病理性疼痛、癫痫相关的神经元过度兴奋及神经递质释放增加(Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113)，已被FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周神经痛、癫痫、纤维肌痛等。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强(Curr.Med.Res.Opin.2006,22:375-384)，因此被国际疼痛学会(IASP)、欧洲神经病学学会联盟(EFNS)和英国NICE等多个国际指南推荐为一线治疗药物。自上市以来，普瑞巴林全球销售额快速增长，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，2012年全球销售额已突破40亿美元，市场前景十分广阔。

国内外报道了大量有关普瑞巴林及其中间体化学合成工艺，可归为、不对称催化法、手性拆分法手性配体法和手性化合物直接合成法等四大类。化学法由于工艺步骤冗长、手性拆分试剂昂贵、反应条件苛刻、有毒有害溶剂用量大，而无法实现规模化生产。生物催化法由于反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点成为最受瞩目的医药及精细化学品合成技术之一。辉瑞公司开发的普瑞巴林生产工艺引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸（Ⅱ）。该手性中间体经脱羧、碱性水解、氢化等步骤制得普瑞巴林（Ⅰ）(Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398；US20050283023；US8134023B2)。

随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展（Curr.Opin.Struc.Biol.2011,21:473-480）。获得能高效制备手性中间体Ⅱ的生物催化剂对制备普瑞巴林具有重要的意义。

（三）发明内容

本发明的目的在于通过易错PCR和定点突变技术对疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶进行改造，提供一种突变体蛋白，提高其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的活力，从而有利于该脂肪酶在普瑞巴林中间体制备中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如下的肽段经点突变获得：RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVT SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLWYFGPI SECD（SEQ ID No.1）；所述的点突变为下列之一或两者结合：（1）第63位的S突变为L或M；（2）第232位的D突变为A。

本发明使用多轮易错PCR方法对脂肪酶Lip-T编码基因进行随机突变，连接表达载体后转化宿主大肠杆菌，诱导表达后再通过高通量筛选方法将正突变检出，然后利用定点突变方法，得到活力进一步提高的突变体。获得的突变体能催化高浓度（2.0～3.0mol/L）的2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。