[发明专利]基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微全分析系统的生物学检测技术领域，尤其涉及的是基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法。

背景技术

微小核糖核酸MicroRNA(miRNA)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成，通常靶向一个或者多个mRNA，通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。至今为止已经发现了3000多个miRNA，其中大部分在动物体内都起着关键性的调控作用，是最主要的基因表达调控因子之一，据估计人体内大约2／3的基因都受到某个或一组miRNA的调控。因此发展miRNA的新型检测方法对于医学临床诊断具有重要意义。已发展的miRNA检测方法主要有微阵列芯片杂交分析技术、基于miRNA的RT-PCR技术、酶促发光技术、深度测序技术、电化学方法、微流控微阵列技术、微阵列RNA引物延伸技术及微球酶标记等技术，这类技术大都检测灵敏度有限，而且需要较大体积的检测溶液，使得在高灵敏微量分析领域的应用受到局限。微流控微珠阵列芯片是微流控芯片研究领域中发展的一种新型芯片模式，其优势包括：传感微球能够提供较大的表面积用于识别分子的固定；微球均相识别过程减少了反应时间；探针阵列形成过程和修饰过程的分离减少了成本；反应在微流控芯片中进行，极大减少了样品量且提高了检测灵敏度。该技术的发展较好解决了微量样品条件下高通量、高灵敏检测的难题，同时检测过程简单，不需要昂贵的检测仪器，为发展未来自动化高性能生物分子检测平台技术提供了新的方向，该技术用于微小核糖核酸的分析未见报道。

利用去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶介导的引物延伸技术检测miRNA，由于采用了常规杂交及酶促延伸双重特异性，与其他技术比较，该技术特异性较好，同时杂交前miRNA不需要标记，杂交后也不需要信号放大，极大简化了反应流程，增加了结果的可靠性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法。

本发明的技术方案如下：

基于微流控微珠阵列芯片和DNA聚合酶介导引物延伸技术的微小核糖核酸检测方法，其步骤如下：

(1)生物素修饰的微小核糖核酸捕获探针通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，该微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；

(2)将含有微小核糖核酸的样品溶液流入步骤(1)中形成的微流控微珠阵列检测芯片，微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交形成DNA／RNA二聚体；

(3)流入DNA聚合酶溶液及生物素化延伸底物，以微小核糖核酸为引物，捕获探针为模版，通过DNA聚合酶介导的延伸反应，将生物素化延伸底物增加在微小核糖核酸的3’末端；其中介导反应时间为15～20min；

(4)流入亲合素标记的量子点，该量子点能与微小核糖核酸上结合的生物素识别并固定；

(5)通过计算流入微小核糖核酸后微球表面荧光进行定性和定量。

所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(1)中，所述的捕获探针的3’末端包含由10个胸腺嘧啶和10个胞嘧啶构成的伸展序列；5’末端包含由5个胸腺嘧啶构成的模版序列。

所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(1)中，所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的一种。

所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(2)中，所述的微小核糖核酸与微球表面的捕获探针杂交的时间为25～35min。

所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(3)中，所述的DNA聚合酶为去除外切酶活性的Klenow DNA聚合酶；生物素化延伸底物为biotin-11-dATP，其浓度为0.5～1.5μM。

所述的微小核糖核酸检测方法，步骤(4)中，所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种；其发射范围为400nm～700nm。