[发明专利]一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法

权利要求书

1.一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于包括前处理、PCR反应、电泳检测步骤，具体包括：

A、前处理：待测样品与DEPC处理的PBST溶液混合后进行研磨，离心后取上清液备用；根据GenBank序列数据库中烟草花叶病毒序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的影响筛选用于复合PCR的不同病毒检测引物对，在PCR管中加入用DEPC溶液稀释的病毒特异性抗体，混合抗体包被于无RNA酶及DNA酶的PCR管备用；取上清液50μl加入PCR管中，36~38℃放置0.5~1.5h以捕捉或沉淀对应的病毒粒子，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR管内壁2~4次，吸出PCR管中液体，再用DEPC处理水洗涤1~2次PCR管内壁，吸出PCR管中液体，离心，吸净PCR管中液体，PCR管3~5℃放置待用；

B、PCR反应：在PCR管中以病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链，应用烟草花叶病毒引物对进行复合PCR反应；

C、电泳检测：取反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的烟草花叶型病毒为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或烟草脉带花叶病毒。

3.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的混合抗体包被为在PCR管中加入终浓度分别为1:10000、1:5000和1:5000的烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草脉带花叶病毒多抗稀释液100μl，3~5℃包被过夜或36~38℃包被0.5~1.5h后，吸出PCR管中液体，用经DEPC处理的PBST溶液洗涤PCR内壁1~3次，吸进管中液体，PCR管待用。

4.根据权利要求1或3所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的DEPC处理的PBST溶液为含有0.01%吐温20的0.1mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，高压灭菌30min得到。

5.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的待测样品与DEPC处理的PBST溶液的重量比为1：5~10。

6.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的DEPC处理水为超纯水中加入0.2%DEPC充分混匀后放置过夜，121℃高温高压灭菌30min得到。

7.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于A步骤中所述的离心转速为5000 ~10000r/min，离心5~10min。

8.根据权利要求1所述的烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的RNA模板为高温变性法、沉淀法、抗体捕获法获得。

9.根据权利要求1所述烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于B步骤所述的烟草花叶病毒引物对为：

。

10.根据权利要求1所述烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法，其特征在于所述的PCR反应的体系为50 μL，其中10 倍Taq酶缓冲液5 μL、10 mmol/L 浓度的6种引物各1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 3 μL、Taq酶 1 μL、灭菌超纯水15 μL；反应条件为94℃预变性4min；94℃变性1min， 58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10 min。