[发明专利]一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒学检测技术领域，具体涉及一种烟草花叶型病毒的快速灵敏检测方法。

背景技术

烟草病毒病是一类在烟草上普遍发生且危害严重的侵染性病害，也是世界范围内的重要病害之一。20世纪50年代以来，烟草病毒病先后在世界各主产烟区相继暴发流行，并日趋严重，引起了世界各烟草种植国的广泛关注。尤其是自20世纪80年代以后，烟草作为一种重要的经济作物，其病原病毒得到了广泛而深入地研究。

云南作为我国最大烟草种植区，常年烟草植烟面积约为700万亩左右，是我省农业生产主要经济作物之一。近年来，由于栽培方式变化、烟草品种单一化以及环境中毒源的不断积累，烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒属病毒成为云南烟区病毒病原，其为害范围和严重程度年度间波动加大，对不同烟区的烟草生产带来较大的影响，明确各种病原的侵染循环途经和重要中间寄主，才能有效降低病害对烟叶产质量的危害。

烟草花叶病毒是(Tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的典型成员，病毒粒子为长杆状，长300～310 nm，直径18 nm，粒子中央有一个宽约2.3 nm的心线，病毒粒子呈螺旋对称结构。病毒粒子非常稳定，体外存活期（LIV）约3000天（Andrew M. Q. King等，Virus Taxonomy，2012）。该病毒病自苗期至大田期均可发生，主要症状表现为轻微花叶、重花叶、斑块状褪绿及黄化。苗期感染导致植株矮化，花叶在发病后期可产生褐色坏死斑点。烟草花叶病毒主要通过病汁液接触传播，有时也通过胚带毒的种子传播，但在烟草中未发现病毒可侵染胚，此外还可通过嫁接传毒（云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年）。

黄瓜花叶病毒（Cucumber  mosaic  virus，CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。该病毒具有非常宽的寄主范围，可通过多种蚜虫以非持久方式传播侵染多种双子叶和单子叶植物。病毒粒子为等轴对称的二十面体，无包膜，三个组分的粒子大小一致，直径为28～30 nm。病毒含有4份基因组，即RNA1、RNA2、RNA3和RNA4，，通常还存在卫星RNA分子。烟叶粗汁液的钝化温度为55～70℃，10min，稀释限点（DEP）为1×10-3～1×10-6，体外存活期（LIV）1～10天（Andrew M. Q. King等，Virus Taxonomy，2012）。CMV可在烟草整个生育期侵染危害，通常引起烟草叶片出现深绿、浅绿相间的花叶，且常呈现多种畸形，病叶或变窄、变薄、扭曲、无光泽；或发脆，叶基变长，叶尖细长；有的病叶叶缘上卷，或出现黄绿色或深绿色的泡斑；有时叶片侧脉出现褐色坏死斑，或沿叶脉有深褐色的闪电状坏死；早期感染病毒的烟株矮缩、根系发育不良（云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年）。

烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。病毒粒子呈弯曲线状，无包膜，长约600～750nm，直径11～13nm，螺旋对称结构，可在感病寄主体内形成风轮状内含体。烟叶粗汁液的钝化温度为50～62℃，10min，稀释限点（DEP）为1×10-2～1×10-6，体外存活期（LIV）7～50天（Andrew M. Q. King等，Virus Taxonomy，2012）。病毒引起的主要症状表现为发病初期叶片中脉出现明脉及斑驳症状，不久叶脉两侧的组织呈深绿色带状斑（通称脉带）。常可延伸到小叶脉，最终叶脉及邻近叶组织变成褐色到黑色坏死斑，可引起全株死亡。自然条件下，TVBMV主要靠多种蚜虫以非持久方式传毒。带毒蚜虫、田间带病毒茄科作物及杂草是大田传播的主要毒源。在人工接种时，可通过机械摩擦传播（云南省烟草科学研究所，烟草微生物学，2008年）。

2012-2013年在云南各植烟区田间调查发现，在烟草生长中后期，烟草花叶型病毒病发生危害普遍且严重影响了烟叶产质量，经系统检测鉴定，这一时期主要病原为烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和烟草脉带花叶病毒，但田间对这类花叶型病毒病病原难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施；在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。

发明内容