[发明专利]预测肝衰竭预后的GSTP1甲基化定量检测法及试剂盒

说明书

技术领域

 本发明涉及基因启动子甲基化定量检测技术领域，具体涉及预测肝衰竭预后的谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）基因启动子甲基化定量检测法及试剂盒。

背景技术

肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群，它是由多种因素导致肝细胞大量坏死，造成严重肝脏损害，致使肝脏合成、排泄、解毒及生物转化等功能出现失代偿或者发生严重障碍的综合征。肝衰竭主要表现为黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病及腹水等。慢加急性肝衰竭（ACLF）是指在慢性肝病的基础上，短期内肝脏功能急剧恶化，出现肝衰竭。在我国肝衰竭的主要病因是肝炎病毒（约占85%-95%，主要是乙型肝炎病毒）感染，其次是药物及肝毒性物质（如酒精、化学制剂等）。而我国属乙型肝炎高流行区，乙型肝炎发病人群众多，2006年乙型肝炎流行病学调查结果表明，我国一般人群乙肝病毒表面抗原携带率为7.18%。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。慢性HBV感染者急性发病，进展为慢加急性肝衰竭，称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎（ACHBLF）。ACHBLF病情凶险，预后差，病死率极高，且目前临床上尚无评估病情及预测预后的有效方法与手段。因此，迫切需要开发用于肝衰竭病情评估及预后判断的方法，有助于临床医生制订有效的治疗措施，以降低肝衰竭的发病率和死亡率。

慢加急性肝衰竭发病非常复杂，病毒和宿主等因素均参与其发生及发展过程。表观遗传学已被证实参与慢性HBV感染的重症化过程，并在其中发挥重要作用。表观遗传学是研究基因表达及功能改变的一门科学，它本身并不涉及基因组DNA序列的改变。表观遗传学调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰等方式。其中，DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸中的甲基转移到特定碱基上的过程。在人类基因组中，DNA甲基化主要出现在特定基因启动子区的CpG岛的胞嘧啶上，从而抑制基因的转录，使基因表达沉默。

谷胱甘肽抗氧化酶系统是人体内重要的酶系抗氧化系统。该系统主要包括谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及谷胱甘肽巯基转移酶（GST）。其中，GST是参与人体内生物转化的Ⅱ相代谢酶。GST主要存在于肝细胞内，可使有害的亲电物质与GSH结合，将其排出体外。除此之外，GST也可促进GSH与毒性代谢产物结合，清除自由基，从而发挥保护机体核酸和蛋白质的功能。GST超家族主要有8个亚家族—α、μ、π、θ、τ、σ、ο和κ。其中谷胱甘肽S-转移酶P1（简称GSTP1）是GST-π亚家族的重要成员之一，也是目前GST家族中研究较多的成员。GSTP1基因是一个编码调控GSTP1蛋白酶的解毒基因，它定位于染色体的11q13，全长3kb，包括7个外显子和6个内含子。GSTP1具有极强的抗氧化能力，可保护肝细胞免受氧化剂的攻击。GSTP1基因失活时，GSTP1蛋白酶的生物学功能减低甚至丧失。研究表明，GSTP1基因启动子甲基化程度与其表达水平呈负相关。我们既往研究发现，肝衰竭患者体内存在不同程度的氧化损伤。氧化损伤在肝衰竭的发生发展过程中具有重要作用。GSTP1基因启动子高甲基化导致的GSTP1表达减少可加重氧化损伤引起的肝损害。GSTP1基因启动子的甲基化与ACLF之间存在密切关系。因此，ACLF患者GSTP1甲基化状态的改变可反映病情与预后。

检测DNA甲基化的方法众多，实时定量甲基化特异性聚合酶链反应检测方法是现阶段研究基因甲基化水平的有力手段。该方法是基于Taqman荧光探针的甲基化定量检测方法，结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的Taqman探针，通过荧光探针追踪PCR产物，实时反映甲基化特异性PCR过程，分析甲基化特异性PCR产物，从而得到待测样本的甲基化程度。实时定量甲基化特异性聚合酶链反应检测方法可克服甲基化定性检测方法的缺点，消除非特异性扩增，更好的避免DNA污染对结果的影响，确保检测结果的特异度。该检测方法能够检测到人体外周血中极微量的DNA，灵敏度高，特异性强，被广泛应用于检测DNA含量少、损失率高的标本。

发明内容

本发明的目的是提供一种预测肝衰竭预后的谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）基因启动子甲基化定量检测的方法及试剂盒，为临床医生评估肝衰竭患者病情与预后，指导治疗提供参考依据。

为实现此目的，本发明提供了预测肝衰竭预后的GSTP1甲基化定量检测法及试剂盒