[发明专利]一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体及其构建方法

权利要求书

1.一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体，其特征是：这种慢病毒载体具有以下结构：在慢病毒5’和3’LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区含有BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列；EF1a启动子转录表达Flag标签融合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆位点含有HpaI、EcoRI和NheI3种酶切位点用于插入外源基因，其中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入；IRES用于启动表达EGFP报告基因；实现一条由EF1a转录的RNA可以产生两个蛋白，即过表达外源蛋白和EGFP。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体的构建方法，其步骤是：

1)pUC-EF1a-IRES-EGFP载体的构建：对EF1a-IRES-EGFP元件进行克隆，将克隆得到的EF1a-IRES-EGFP用EcoRI和PstI双酶切，选择pUC18作为原始质粒，用EcoRI和PstI双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EF1a-IRES-EGFP元件进行连接；

2)pLL3.7-CQ载体的构建：设计合成正反向引物ENZYf1，其序列为5’-TGGATCCGCGCGGTGACC-3’，和ENZYr1，其序列为5’-TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3’，用于形成shRNA插入位点，正反向双链的退火，选择慢病毒载体pLL3.7作为原始质粒，用HpaI和XhoI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接；

3)pUC-Flag-EGFP载体的构建：设计合成正反向引物FlagF(5’-GATCAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3’)和FlagR(5’-CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3’)用于形成带有Flag标签的多克隆位点，正反向双链的退火，选择pUC-EF1a-IRES-EGFP作为原始质粒，用BamHI和NheI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接；

4)pLenti-FlagN-shRNA载体的构建：对EF1a-Flag-EGFP元件进行克隆，前面PCR克隆得到的EF1a-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，选择慢病毒载体pLL3.7-CQ作为原始质粒，用NsiI和PvuII双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EF1a-Flag-EGFP元件进行连接，最终获得插入序列和方向均正确的载体即pLenti-FlagN-shRNA。