[发明专利]一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种慢病毒载体，尤其是一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体及其构建方法。

背景技术

慢病毒载体是由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)改造而来，它最大限度的消除了HIV的致病性，且不能自我复制，带有人工合成的外源基因和人工改良的病毒外衣。慢病毒载体的优点是1)可以感染多种细胞系，包括分裂与非分裂时期的细胞；2)极小的毒性和免疫反应；3)高效率地整合到宿主基因组内，形成稳定的外源基因表达，非常适合建立稳定的转基因小鼠和人ES细胞系。

常规基因研究的主要方法是将外源基因导入到细胞内使其过表达，或者通过基因敲除和RNA干扰方法使其低表达，然后分析细胞以及生物体所发生的表型改变和内在基因表达变化，从而推断基因的功能和作用。如今随着人类基因组图谱基本完成，后续研究重点已经从基因水平移到了蛋白水平，人们发现蛋白的后修饰和突变比基因组更加复杂，也更重要。常规的单纯过表达人工改造的基因并不能消除内源基因的干扰，而单纯RNA干扰又不能研究具体哪一个氨基酸在该蛋白中的发挥着重要作用。如果同时进行RNA干扰和过表达人工改造的基因，常规方法需要用两步法先后干扰和过表达基因，操作非常繁琐。而且如果该基因对细胞存活极其重要，往往无法得到干扰或过表达的中间产物，使整个实验无法进行。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种一步法高效替换细胞内基因的慢病毒载体及其构建方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种新型替代内源基因表达的慢病毒载体具有以下结构：采用载体pLL3.7、pUC18和lv-Lin28-GFP(上海斯丹赛)作为原始质粒，在慢病毒5’和3’LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区含有BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列；EF1a启动子转录表达Flag标签融合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆位点含有HpaI、EcoRI和NheI3种酶切位点用于插入外源基因，其中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入；IRES用于启动表达EGFP报告基因；实现一条由EF1a转录的RNA可以产生两个蛋白，即过表达外源蛋白和EGFP。

这种新型替代内源基因表达的慢病毒载体的构建方法如下：

1)pUC-EF1a-IRES-EGFP载体的构建：对EF1a-IRES-EGFP元件进行克隆，将克隆得到的EF1a-IRES-EGFP用EcoRI和PstI双酶切，选择pUC18作为原始质粒，用EcoRI和PstI双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EF1a-IRES-EGFP元件进行连接；

2)pLL3.7-CQ载体的构建：设计合成正反向引物ENZYf1(5’-TGGATCCGCGCGGTGACC-3’)和ENZYr1(5’-TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3’)用于形成shRNA插入位点，正反向双链的退火，选择慢病毒载体pLL3.7作为原始质粒，用HpaI和XhoI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接；

3)pUC-Flag-EGFP载体的构建：设计合成正反向引物FlagF(5’-GATCAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3’)和FlagR(5’-CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3’)用于形成带有Flag标签的多克隆位点，正反向双链的退火，选择pUC-EF1a-IRES-EGFP作为原始质粒，用BamHI和NheI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接；

4)pLenti-FlagN-shRNA载体的构建：对EF1a-Flag-EGFP元件进行克隆，前面PCR克隆得到的EF1a-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，选择慢病毒载体pLL3.7-CQ作为原始质粒，用NsiI和PvuII双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EF1a-Flag-EGFP元件进行连接，最终获得插入序列和方向均正确的载体即pLenti-FlagN-shRNA。

发明有益的效果是：本发明通过shRNA干扰技术将内源基因进行RNA干扰，同时又能够过表达外源经过改造的同一个基因，实现用人工改造的基因替代生物体内原有基因，该载体为慢病毒载体，可以高效整合到宿主细胞内，长期高效发挥基因替代功能，克服了以往载体的缺点，提供了一种快速、高效的细胞内基因改造的手段。

附图说明