[发明专利]鸡外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

权利要求书

1.鸡外周血单核淋巴细胞PD-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20℃，备用；采用普通PCR方法扩增PD-1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，然后将PD-1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；

普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水； 

其中，正向引物F为：5′-GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3′，

反向引物R为：5′-TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3′。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述目的基因片段为序列表中的SEQ ID No.1序列。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：其中普通PCR扩增时的反应程序为：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。

4.一种鸡外周血单核淋巴细胞PD-1基因的丰度实时检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

（1）将回收纯化的PD-1目的基因片段与pMD 18-T载体连接，然后转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒；经克隆筛选后进行测序分析，选取与PD-1目的基因片段相同序列的阳性质粒作为标准品质粒，测定标准品质粒的DNA浓度，并换算成质粒的拷贝浓度，按1:10倍的浓度梯度稀释阳性质粒；

（2）以稀释的阳性质粒为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，反应结束后绘制出标准曲线，然后根据荧光信号的变化及标准曲线测出样品DNA中PD-1的基因丰度；

其中实时荧光定量PCR扩增的反应体系为20μL，包括2μL质粒模板，浓度均为20μmol/L的正向引物F和反向引物R各0.2μL，SYBR Green I PreMix 10μL，三蒸水7.6 μL；

其中，正向引物F为：5′-GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3′，

反向引物R为：5′-TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3′。

5.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于：所述目的基因片段为序列表的SEQ ID No.1序列。

6.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于：实时荧光定量 PCR反应程序为：95℃热启动 30s；94℃变性5s；60℃退火和延伸34s，60℃时收集荧光信号，再40个循环。

7.根据权利要求4所述的丰度实时检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR反应时采用的实时荧光定量PCR仪为ABI 7500 Fast型荧光定量PCR仪。

8.根据权利要求4-7任一项所述的丰度实时检测方法，其特征在于：所述稀释的阳性质粒浓度范围为4.36×10¹⁰-4.36×10¹ copies/μL；所述标准曲线的相关系数R²=1.0，斜率为-3.484。

9.权利要求4-7任一项所述的检测方法在分析鸡感染免疫抑制性疾病后PD-1基因的转录水平变化规律中的应用。