[发明专利]鸡外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及鸡外周血单核淋巴细胞PD-1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起雏鸡的一种急性、高度接触性传染病。研究表明，IBDV感染后可引起机体的免疫抑制状态和持续性感染。病毒感染的靶器官为法氏囊，病毒在B细胞内复制导致法氏囊淋巴滤泡损伤、破坏，B淋巴细胞溶解。同时，病毒在法氏囊单核-巨噬细胞系统内复制导致炎性介质的大量分泌、病毒扩散和损伤加剧，形成败血性休克综合征，导致严重的B细胞免疫反应抑制，并加剧了病鸡的死亡。另外，IBDV感染后前B淋巴细胞增殖的抑制和凋亡的发生，也是造成体液免疫抑制的重要原因。

程序性死亡分子1(programmed death-1, PD-1或CD279)是免疫球蛋白超家族成员之一，最早在T细胞杂交瘤细胞凋亡调节研究中发现，Ahmed及其同事在LCMV慢性感染小鼠模型中证实，PD-1是T细胞表面的一种抑制性受体，阻断PD-1与其配体的结合可以使病毒持续性感染时功能障碍或衰竭的CD8⁺ T细胞功能恢复。经研究证实，当T细胞受到一些激活因素刺激后，PD-1能够被诱导表达在CD4⁺、CD8⁺ T细胞、自然杀伤性T细胞、B细胞、单核细胞及树突状细胞等表面。在免疫调节方面，PD-1与其配体PD-Ls共同介导PD-1:PD-Ls信号通路的激活，在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，对抗原特异性T、B细胞的功能、T细胞的增殖、细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能。经相关研究证实，一些病毒的感染可以诱导PD-1及其配体PD-Ls的表达从而影响PD-1:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤，引起机体产生免疫抑制和持续性感染。因此，PD-1及其配体PD-Ls近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点，而在动物免疫抑制性疾病或病毒持续性感染方面，T细胞免疫抑制性受体PD-1:PD-Ls的研究才刚刚起步，特别是在家禽类该方面的研究还少见报道。

近年来，荧光定量PCR（Real-Time PCR） 技术为基因丰度检测提供了全新的方法，和传统的方法相比，该方法具有敏感性高、特异性强、操作简便、成本低以及定量准确等优点被广泛应用，它可以通过检测目标序列PCR扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的；然而对鸡外周血单核细胞中PD-1基因丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：本发明提供了一种鸡外周血单核淋巴细胞PD-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法；

在此基础上本发明建立了一种PD-1基因丰度的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；

本发明通过研究外周血单核细胞中PD-1的变化规律，为鸡PD-1分子检测的定量分析提供了技术平台，并能用于分析鸡感染免疫抑制性疾病如IBD后PD-1基因的转录水平的变化规律。

本发明的技术方案：

鸡外周血单核淋巴细胞PD-1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

采集雏鸡的外周血，分离出淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20℃，备用；采用普通PCR方法扩增PD-1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化，然后将PD-1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；

普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水； 

其中，正向引物F为：5′-GGACTACGGTGTGCTGGAGTT-3′，

反向引物R为：5′-TCTTTCCTCGCTCTGGTGTG-3′。

所述目的基因片段为序列表中的SEQ ID No.1序列。