[发明专利]一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌

权利要求书

1.一种生产β-胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF；所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒pET32a(+)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌基因工程菌的培养方法包括接种于LB培养基中进行培养，培养至菌体浓度至诱导浓度时加入诱导剂IPTG，即表达导入的外源基因。

3.一种高产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF，所述的含四个MEP途径基因的表达载体的载体骨架是质粒pTrcHis2B或者质粒pET32a(+)。

4.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的载体骨架是质粒pTrcHis2B。

5.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体为含有包括该四基因的β-胡萝卜素合成基因簇的表达载体。

6.如权利要求5所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的β-胡萝卜素合成基因簇是来自成团泛菌CGMCC NO.1.2244的β-胡萝卜素合成基因簇。

7.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体是质粒pACYC184-M-crt。

8.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

9.如权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备而得：

(1)基因克隆

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(2)表达载体构建

将胶回收后的dxs基因与载体pET32a(+)分别用NcoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs，

将胶回收后的idi基因与载体pET32a(+)-dxs分别用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi，

将胶回收后的ispDF基因与载体pET32a(+)-dxs-idi分别用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF；

(3)转化宿主细胞

将质粒pET32a(+)-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得重组菌株pET32a(+)-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)；

或者，由包括以下步骤的方法制备而得：

(1)基因克隆

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得dxs基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示,

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得idi基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示,

以大肠杆菌K12 MG1655基因组DNA为模板进行PCR扩增，得ispD基因和ispF基因，其中PCR所用引物的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；

(2)表达载体构建

将胶回收后的dxs基因与载体pTrcHis2B分别用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs，

将胶回收后的idi基因与载体pTrcHis2B-dxs分别用XhoⅠ和PstⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi，

将胶回收后的ispDF基因与载体pTrcHis2B-dxs-idi分别用PstⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，连接，得重组质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF；

(3)转化宿主细胞

将质粒pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF与质粒pACYC184-M-crt同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得重组菌株pTrcHis2B-dxs-idi-ispDF-pACYC184-M-crt(DE3)。