[发明专利]一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌

说明书

本发明公开了一种生产β‑胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β‑胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β‑胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β‑胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β‑胡萝卜素的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。

背景技术

β-胡萝卜素属于萜类化合物，是类胡萝卜素家族中的一员，在食品、药品、化妆品和保健品中有着广泛的应用。

目前，β-胡萝卜素的生产方法有化学合成品的生产及天然品的生产方法，而化学合成产品全为反式结构，天然品为顺式和反式混合型。化学合成以维生素A合成过程中的中间体C₁₄醛、维生素A为原料开始合成，而天然品的产生方法主要是从天然植物、蚕粪、盐藻和微生物发酵液中提取。由于人们对β胡萝卜素药理活性的要求，天然品逐渐成为一种趋势。

β-胡萝卜素属于萜类化合物，合成萜类化合物的内源性途径主要有甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径，其中MEP途径主要存在于植物的质体、细菌和藻类等，MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中。这两类代谢途径的终产物均是萜类化合物的共同的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）和异戊酰焦磷酸（IPP），之后在β-胡萝卜素合成基因存在下合成β-胡萝卜素。

微生物具有生产快、发酵周期短、遗传背景清晰、易于工程化操作等优点。近年来随着合成生物学的不断发展，人们对利用基因工程生产β-胡萝卜素进行了广泛的研究，主要是针对单个基因进行调控，过表达MEP途径中的单个基因，来提高β-胡萝卜素的产量。但是这些方法操作复杂，菌株稳定性较差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的生产β胡萝卜素的方法操作复杂，稳定较低的问题，提供一种生产β-胡萝卜素的方法及其所用的大肠杆菌基因工程菌。

本发明的技术方案之一是：一种生产β-胡萝卜素的方法，包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因）、crtB（茄红素合成酶基因）、crtI（番茄红素合成酶基因）和crtY（β-胡萝卜素合成酶基因），其中，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs（脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因）、idi（异戊酰基焦磷酸异构酶基因）、ispD（4-二磷酸胞苷甲基-D-赤藓糖醇合成酶基因）和ispF（2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合成酶基因）。

本发明所述的大肠杆菌基因工程菌的培养方法同常规的大肠杆菌培养方法，包括接种于LB培养基中进行培养，培养至菌体浓度至诱导浓度时加入诱导剂IPTG，即表达导入的外源基因，从而产生β-胡萝卜素。然后从发酵液中获得β-胡萝卜素。从发酵液中获得β-胡萝卜素的方法是本领域的常规方法。

本发明的技术方案之二是：一种高产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtB、crtI和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。

本发明所述的大肠杆菌基因工程菌含有含四个MEP途径基因的表达载体。大肠杆菌原基因组中含有上述四基因，通过外源的该四基因的导入，增加大肠杆菌上述四基因的拷贝数。