[发明专利]一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法

权利要求书

1.一种从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括胎盘的收集、胎盘的初检、胎盘的预消毒、胎盘及母血检测、胎盘造血干细胞的灌洗、造血干细胞的浓缩纯化的步骤，其分别为：

（1）胎盘的收集：在手术室无菌环境下收集胎盘及母血，存放于无菌的胎盘储运盒中，贴好标签、条码，胎盘储运盒的温度保持在4-10 ℃，24小时内送达实验室；

（2）胎盘的初检：检查胎盘储运盒盒内温度、标签、送达日期、储运盒是否有渗漏、是否有母血血样；

（3）胎盘的预消毒：将胎盘的胎儿面展开放置于胎盘冲洗盒的底部，用生理盐水冲洗胎盘表面，打开胎盘冲洗盒底面的排水孔，去掉冲洗的生理盐水，检查胎盘表面钙化情况；

（4）胎盘及母血检测：对所取的胎盘和母血样本进行检测，检测的项目包括肝炎病毒检测、艾滋病毒检测、性病检测、组织配型（HLA）检测、造血干/祖细胞定性检测（CFU-GM）；

（5）胎盘造血干细胞的灌洗：将胎盘在无菌条件下用无菌生理盐水清洗掉胎盘上的血凝块及积血，采用消毒剂消毒后，将灌注液针头插入胎盘脐动脉中，胎盘灌注回收瓶针头插入脐静脉中，止血钳夹紧，缓慢开启恒流泵，灌注液经胶管、开关、蠕动泵、针头、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；

（6）造血干细胞的浓缩纯化：将灌洗出来的灌洗液，在离心机中以1500-2000 rpm离心15-20分钟，去掉上清液，收集沉淀和下层的液体，将收集到的沉淀和下层的液体与生理盐水按2：1-1：2的比例混匀得混合液，然后将混合液和淋巴细胞分离液按2：1-1：2的比例分别加入到离心管中，添加的顺序为先在离心管中加入淋巴细胞分离液，再缓慢加入混合液，加入过程中注意保持淋巴细胞分离液的液面平整，加完后以2200-2500 rpm离心20-25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层到新的离心管中，以2：1-1：2的比例加生理盐水混匀，1200-1500 rpm离心10-15分钟；离心结束后去掉上清液，加入10-20 mL生理盐水吹打沉淀，再1200-1500 rpm离心10-15分钟，离心结束后，去掉上清液，用DMEM培养基重悬沉淀，收集造血干细胞群，将重悬的细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测（CD34），造血干细胞活性检测（台盼蓝染色），造血干细胞定性检测（CFU-GM）。

2.根据权利要求1所述的从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，其特征在于，所述的造血干细胞的灌洗步骤为：

开始灌洗时使用的灌洗液是每500 mL DMEM培养基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液（1 mL：5 mg）2支、肝素钠注射液（2mL：12500单位）2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000 mL灌洗液；关闭恒流泵，将灌洗液换成每500 mL DMEM培养基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液（1 mL：5 mg）2支，肝素钠注射液（2 mL：12500单位）2支，AMD3100（5 mg/瓶）0.5瓶的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500 mL灌洗液；配制灌洗所用的DMEM培养基、10%的FBS使用前先放置于37 ℃的水浴锅中，提前预热到37 ℃。

3.根据权利要求1所述的从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，其特征在于，所述的造血干细胞的灌洗步骤为： 

开始灌洗时使用的灌洗液是每500 mL DMEM培养基中加入10% FBS 50 mL、硝酸甘油注射液（1 mL：5 mg）2支、肝素钠注射液（2mL：12500单位）2支，混匀制得的灌洗液，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗了1000 mL灌洗液；关闭恒流泵，将灌洗液换成50 mL含AMD3100的浓度为100 mg/L的DMEM培养基，以每秒钟10滴灌洗液的速度灌洗5分钟，灌洗，灌洗完后；关闭恒流泵，30分钟后，将灌洗液换成每500 mL DMEM培养基中加入10% FBS 50 mL，硝酸甘油注射液（1 mL：5 mg）2支，肝素钠注射液（2 mL：12500单位）2支，AMD3100（5 mg/瓶）0.5瓶的灌洗液，开启恒流泵，以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2.5小时，灌洗了1500 mL灌洗液，回收灌洗液。

4.根据权利要求1所述的从胎盘中灌洗造血干细胞的方法，其特征是，所述的造血干细胞浓缩纯化还可以是：将灌洗出来的灌洗液，离心，离心的条件是：转速1500 rpm，加速时间45 s，减速时间45 s，离心时间20 min，离心结束后，将回收瓶转移到无菌操作台中，移液枪吸走上层液体，留血细胞沉淀，往血细胞沉淀中加入10-20 mL的生理盐水，轻轻吹打起沉淀，取50 mL离心管，每管加入20 mL的淋巴细胞分离液，倾斜含淋巴细胞分离液的离心管，用移液枪吸取吹打起来的血细胞沿着离心管管壁缓缓加入到淋巴细胞分离液上，加的过程要缓慢，保持淋巴细胞分离液液面平整，每管加入血细胞25 mL；移液完成后，离心，离心条件：转速2200 rpm，加速时间600 s，减速时间600 s，离心时间20 min；离心结束后，溶液会分四层，用移液管吸取中间白膜层，每管20 mL转移到新的50 mL离心管中，然后每管加入20 mL的生理盐水，混匀后，离心，离心的条件：转速1500 rpm，加速时间45 s，减速时间45 s，离心时间15 min；离心结束后，转移到无菌操作台中，去掉上清液，每管加入20 mL的生理盐水吹打沉淀，然后离心，离心的条件：转速1500 rpm，加速时间45 s，减速时间45 s，离心时间15 min；离心结束后，去掉上清液，用20 mL的10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，收集造血干细胞群，将细胞群进行细胞和霉菌培养，造血干细胞定量检测（CD34），造血干细胞活性检测（台盼蓝染色），造血干细胞定性检测（CFU-GM）。