[发明专利]一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株及其应用有效
| 申请号： | 201410039467.7 | 申请日： | 2014-01-27 |
| 公开（公告）号： | CN103740654A | 公开（公告）日： | 2014-04-23 |
| 发明（设计）人： | 廖国阳;李卫东;马磊;杨帆;杨景晖;周健;宋绍辉;蔡玮;寸怡娜;高菁霞;张新文;戴宗祥;姜述德 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学生物学研究所 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12N7/08;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司 53100 | 代理人： | 徐玲菊 |
| 地址： | 650118 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 流感病毒 vero 细胞 适应 及其 应用 | ||
1.一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株，命名为B/Yunnan/2/2005Vca (B)，该毒株的微生物保藏号为：CGMCC NO. 7009。
2.如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流行株的Vero细胞适应株中的应用。
3.如权利要求1所述乙型流感病毒Vero细胞冷适应株在制备流感疫苗中的应用。
4.一种乙型流感病毒Vero细胞冷适应株的制备方法，其特征在于经过以下步骤：
A. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的血凝滴度达到1:512的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，33±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液；
B.将步骤 A收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤A和B，如此连续传3代，并维持种毒细胞收获液的血凝滴度在1:512，得传代乙型流感病毒；
C. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI的步骤B的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，32±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:256，得传代乙型流感病毒；
D. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤C的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，31±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
E. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤D的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，30±1℃条件下，培养72小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
F. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤E的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，29±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:160，得传代乙型流感病毒；
G.. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤F的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，28±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液，其血凝滴度在1:80，得传代乙型流感病毒；
H. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤G的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，27±1℃条件下，培养96-120小时后，收获病毒液；
I. 将步骤H收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤H和I，如此连续传代4代，种毒细胞收获液的血凝滴度在波动于0－1:80，得传代乙型流感病毒；
J. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤I的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，26±1℃条件下，培养96－120小时后，收获病毒液；
K. 将步骤J收获的病毒液反复冻融3次，再次接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤J和K，如此连续传代10代，病毒始终保持低水平复制状态，得再传代乙型流感病毒；
L. 在24小时长成致密单层的Vero细胞上，接种1MOI步骤K的传代乙型流感病毒，在维持母液成分为MEM或DMEM/F12，青霉素-链霉素2万U/ml，谷氨酰胺溶液0.3－0.6mg/ml，牛血清白蛋白1mg/ml，TPCK-胰酶浓度0.5－1.5ug/ml，pH7.0－7.2，25±1℃条件下，培养120-168小时后，收获病毒液；
M. 将步骤L收获的病毒液反复冻融3次，接种到24小时长成致密单层的Vero 细胞上，再重复步骤L和M，如此连续传代31代，得血凝滴度在1:512-1:1024的乙型流感病毒Vero细胞冷适应株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤A的乙型流感病毒B/Yunnan/2/2005Va (B)为现有病毒，其保藏号为：CGMCC No.293。
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