[发明专利]一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法

权利要求书

1.一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体，其特征在于，所述RNAi载体包含shRNA表达框和Ago2蛋白表达框；所述shRNA表达框包含启动子hU6、H1或7SK，以及ccdB致死基因；所述Ago2蛋白表达框包含CMV启动子、Ago2蛋白表达基因、内部核糖体进入位点DNA序列和ZsGreen1绿色荧光蛋白表达基因。

2.根据权利要求1所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体，其特征在于，所述的ccdB致死基因的两端设有限制性酶切位点BamHI和MluI。

3.权利要求1-2任一项所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备用于构建载体的骨架pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro：

以pLVX-IRES-ZsGreen1载体为模板，扩增得到IRES-ZsGreen1片段，用Cla1-Xba1双酶切PCR产物，然后通过相应的位点克隆到pLVX-Puro载体，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro载体骨架。

(2)插入增强因子Ago2基因表达框CMV-Ago2：

用MluI和EcoRI双酶切pIRESneo-FLAG/HA-Ago2载体，得到CMV-Ago2片段，将CMV-Ago2片段与步骤(1)回收的pLVX-IRES-ZsGreen1-Puro载体骨架连接，转入大肠杆菌感受态细胞，涂LB平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到的载体pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro；

(3)插入shRNA表达启动子

用BclI和MluI双酶切步骤(2)得到的载体pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro，去磷酸后电泳回收；用BclI和MluI双酶切扩增hU6、H1或7SK启动子的PCR产物后，连接到pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro载体的相应位点上，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为：pLVX-hU6/H1/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro。

(4)插入ccdB序列得到shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体：

从pLenti6载体扩增含有大肠杆菌ccdB致死基因的片段，用BamHI和Mlu I双酶切后与经BamHI和Mlu I双酶切的pLVX-hU6/H1/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB/amp+Chl双抗平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体，载体骨架是pLVX-hU6/H1/7SK-ccdB-CMV-Ago2-IRES-ZsGreen1-Puro。

4.一种shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，其特征在于，包含权利要求1-2任一项所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体。

5.根据权利要求4所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，其特征在于，还包含目的基因shRNA，所述shRNA的茎部长度为19～22bp，所述shRNA的loop长度是4～9bp。

6.根据权利要求5所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，其特征在于，所述shRNA的茎部长度为20bp。

7.根据权利要求5所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，其特征在于，所述shRNA的loop长度是6～9bp。

8.根据权利要求5所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，其特征在于，所述shRNA的sense/antisense结构是从5’端开始的sense-loop-antisense结构。

9.权利要求4或5所述的shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）针对目的基因设计shRNA编码序列，化学合成两条引物，将两条引物退火形成带限制性内切酶BamHI和MluI黏性末端的shRNA；

2）通过限制性内切酶BamHI和MluI消化shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体骨架，酶切回收后，将载体骨架与退火的shRNA进行连接,转化大肠杆菌感受态细胞并涂板培养过夜；

3）将平板上长出的单克隆菌落进行DNA测序，确定shRNA编码序列的正确插入，得到shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒。