[发明专利]一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于功能基因组学研究领域，涉及一种慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法。

背景技术

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种在进化过程中高度保守的，由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解的基因转录后沉默现象(Fire A.,Nature,1998.391(6669):p.806-11.)。RNAi技术不仅揭示了细胞内基因沉默机制，是继酵母杂交系、DNA芯片、基因敲除、反义RNA等技术后的又一解读基因功能的有效研究手段，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。RNA干扰在细胞中的作用机制分为三个阶段:第一个是起始阶段，外源性或内源性双链RNA分子被细胞内的Dicer酶加工剪切成21-25个核苷酸长度的小分子双链(small-interfering RNAs，siRNA)；第二个是RISC的组装阶段，产生的siRNA中其中一条链与Argonaute（Ago）及其相关蛋白组装形成具有活性的沉默复合体RISC（RNA-induced silencing complex）；第三个是效应阶段，组装形成的具有活性的RISC作用于与其上的单链小分子RNA序列互补的mRNA，通过将该mRNA降解使其翻译受到抑制，最终导致基因的沉默(Siomi,H.and M.C.Siomi,Nature,2009.457(7228):p.396-404)。

但是，在RNAi的实际应用中经常发现，即使是合理设计的shRNA仍不能发挥有效的干扰作用。经过分析，归纳出了影响shRNA干扰效果的几种因素：如驱动siRNA表达的启动子、siRNA作用位点、多个siRNA的串联表达、siRNA与RISC的结合情况和干扰载体的转染效率等(Dykxhoorn,D.M.and J.Lieberman,Annu Rev Biomed Eng,2006.8:p.377-402)。

针对上述问题，研究人员致力于发现增强shRNA干扰效率的RNAi相关蛋白因子。Ago2是Argonaute蛋白家族中唯一包含有切割活性的蛋白质。细胞内RNAi离不开Ago2的参与(Juvvuna P.K..Nucleic Acids Res,2012.40(14):p.6808-20)，Ago2不仅可与siRNA结合，还可通过与miRNA结合从而提高成熟miRNA在细胞中的水平和稳定性(Ghildiyal M.and P.D.Zamore.Nat Rev Genet,2009.10(2):p.94-108)。细胞内的siRNA和miRNA则竞争性地与数量有限Ago2结合，外源导入siRNA可能会导致如下情况：一方面，细胞内大多数Ago2可能被miRNA占据，外源导入的shRNA则可能由于没有足够的Ago2来对其进行装载，从而导致部分shRNA未能发挥作用就被降解；另一方面，研究表明siRNA、shRNA比pre-miRNA在结合RISC方面存在优势，说明进入细胞的外源shRNA可能比miRNA优先占用细胞内RISC即消耗Ago2(Castanotto D.Nucleic Acids Res,2007.35(15):p.5154-64)，那么内源性miRNA可能由于没有足够的Ago2对其进行装载而被降解，导致依赖miRNA途径的细胞活动受到影响。因此，细胞内Ago2的可用数量不足，不仅会影响shRNA干扰作用的发挥，也可能影响细胞内miRNA正常功能的运作。在维持细胞miRNA正常功能的前提下，细胞内RNAi的效率很大程度上取决于可用Ago2的数量。已经有研究证明，过表达Ago2蛋白可以提高哺乳动物细胞内的RNAi效率。