[发明专利]一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。 

背景技术

凝乳是生产原制干酪的关键步骤，凝乳酶在此过程中发挥至关重要的作用，并直接关系到干酪的品质和得率。传统干酪加工中所使用的凝乳酶（rennet）来源于未断奶小牛的第四胃（皱胃），主要由凝乳酶（chymosin）和胃蛋白酶（pepsin）组成。商业化的小牛皱胃凝乳酶其凝乳酶所占比重在50～95%。凝乳酶介导凝乳反应涉及两个步骤：（1）酶解酪蛋白：凝乳酶（Chymosin,E.C.3.4.23.4）对κ-CN具有高度特异性，主要水解κ-CN中的Phe₁₀₅-Met₁₀₆的肽键，生成由106-109残基氨基酸组成的κ-酪蛋白巨肽（κ-casein macropeptide）和由1-105残基氨基酸组成的副κ-酪蛋白（para-κ-casein），凝乳酶也能够水解α_s1-CN、α_s2-CN、β-CN；（2）当足够的κ-CN被水解时，副κ-酪蛋白发生聚集形成三维网状凝胶，Ca²⁺促发酪蛋白胶束聚集，进而引起酪蛋白胶束失稳并形成干酪凝块。 

干酪加工中使用的凝乳酶的早在50多年前凝乳酶的需求已超过其产量，与此同时自1961年以来，世界干酪产量大约增加了3.5倍，小牛皱胃凝乳酶供应量确呈下降趋势，目前，世界小牛皱胃凝乳酶的仅能满足世界干酪产量所需凝乳酶的20～30%。小牛皱胃凝乳酶的供需矛盾和价格高昂、宗教（伊斯兰教和犹太教）、饮食（素食主义）以及食品法规等因素，使得寻求其替代物成为乳品领域科学研究的热点之一，寻求小牛皱胃凝乳酶替代物的研究主要动物、植物、基因重组以及微生物四个方面开展。动物和植物来源的凝乳酶主要用于特定种类的干酪，其来源和产量同样受到限制；利用基因重组技术制备的凝乳酶具有成分单一等优点，但是，一些国家如法国、德国和荷 兰禁止使用重组凝乳酶。 

微生物能够产生许多种酶类，其中绝大部分分泌量很小并涉及细胞代谢过程，胞外酶能够消化不溶的纤维素、淀粉和蛋白质大分子物质，并转移至胞内作为细胞生长的营养物质。许多微生物，尤其是霉菌和细菌来源的胞外蛋白酶具有凝乳酶相似的性质，与植物和动物来源凝乳酶（MCEs）相比较，微生物来源的凝乳酶（MCEs）具有生产成本低、具有更加广泛的生化多样性以及基因改造方法简便等优点。微生物来源凝乳酶可分为两类：（a）来源于曲霉（Aspergillus spp.）和根霉菌（Rhizopus spp.）的类胃蛋白酶（pepsin-like）；（b）来源于毛霉菌（Mucorspp.）、根霉菌（Rhizomucor spp.）和板栗疫病菌（Endothiaparasitica）的类凝乳酶（rennin-like）。目前，米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）、微小根毛霉（Rhizomucorpusillus）和板栗疫病菌（Endotiaparasitica）三种来源的凝乳酶已用于大规模商业化生产中，已占到了全球蛋白酶市场的33%。然而，近年来微生物凝乳酶研究主要集中在芽胞杆菌属（Bacillus），所得蛋白酶通常具有较高的蛋白酶水解活力，并具有耐热性较强、不易灭活，导致蛋白质降解并转化为乳清，因此，对干酪得率具有负面作用，只有部分适合于干酪生产。因此尽管部分微生物凝乳酶已产业化，筛选新型产凝乳酶的微生物菌种仍是该领域的重要研究工作。 

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前存在的凝乳酶来源和产量严重不足的技术问题，提供了一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法及其产物和应用。 

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种具有凝乳酶活性的发酵液提取物的制备方法，其所述制备方法包括以下步骤：利用小麦麸皮培养基培养类芽孢杆菌（Paenibacillus damxungensis sp.nov.）CGMCC No.8333，15℃～40℃，震荡培养18～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。 

本发明所述小麦麸皮培养基包括小麦麸皮和水。其中所述的小麦麸皮为本领域常规的小麦麸皮，所述小麦麸皮的来源较佳地包括：山东、河南和江苏，优选的来源为山东。