[发明专利]人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的方法。

背景技术

一、人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）

人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)为lipocalin（载脂蛋白）家族的一个新成员，是Kjeldsen等人1993年在研究中性粒细胞明胶酶，基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9；即明胶酶B）时发现的。随后，NGAL cDNA及其全基因序列分别于1994和1997年被克隆鉴定。NGAL蛋白由一条多肽链构成，其分子量为25kD的糖蛋白，含有178个氨基酸残基。多肽链由N端的310-螺旋、C端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成了一个lipocalin家族特有的β折叠桶结构。NGAL既能够自身聚合形成46kD的同源二聚体,也能够与MMP-9聚合形成135kD的异源二聚体。在中性粒细胞中NGAL和MMP-9既有独立存在的方式,又有联合存在的方式。这提示NGAL和MMP-9既可以独立发挥作用，又可以相互结合在一起联合发挥功能。

NGAL参与多样的生化过程，涉及胚胎发育、细胞分化、炎症免疫应答、细胞凋亡、脂质代谢、肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等等。其主要功能为：1）参与炎症与天然免疫反应；2）保护调节基质金属蛋白酶-9的活性；3）作为一种新型的铁离子转运载体，介导新的独特的跨膜转铁通路等等。此外，NGAL可能是人类的一种十分重要的癌蛋白，与食管癌等肿瘤密切相关。近年来,随着NGAL蛋白在人体组织细胞中广泛分布的认识,特别是在一些肿瘤组织细胞中该基因异常过度表达的发现，有关NGAL蛋白新功能的研究呈现出活跃发展趋势。

二、基因重组方法制备NGAL

传统方法从病人尿液中提取NGAL具有难以克服的缺点，例如：得率很低；批间差很大；存在生物安全隐患，难于工业化生产等。而基因工程方法来表达，生产重组蛋白质不会存在这些问题。最常用的基因工程蛋白表达系统包括大肠杆菌和酵母系统。

1、大肠杆菌表达系统

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒）转化细菌（通常选用的是大肠杆菌），通过IPTG等诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

作为发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

大肠杆菌系统表达重组蛋白的操作步骤包括：

1）目的基因的取得：目的基因可以从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取，也可以由化学合成法合成有特定功能的目的基因。

2）载体系统的选择：一个优良的载体必须具备几个条件：是一个具自我复制能力的复制子；能在受体细胞内大量增值；只有一个限制性内切核酸酶的切口；其上必须有一种选择性遗传标记。对于大肠杆菌表达系统来说，载体主要是一些松弛型细菌质粒。

3）目的基因与载体DNA的重组：采用限制性内切酶处理产生粘性末端，经过退火后在连接酶的作用下，目的基因就与载体DNA结合形成重组载体。

4）重组载体导入受体细胞：在大肠杆菌表达系统中通过转化法将质粒导入受体细胞，如CaCl₂转化法，电穿击法、热击法等。

5）重组菌株的筛选鉴定：对表达的重组菌株进行抗生素筛选，电泳鉴定后才能大规模培养。