[发明专利]基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-188-5p检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及MicroRNA，尤其是涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-188-5p检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用，具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与Ago蛋白等形成RISC（RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控（Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297）。

由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义。目前，检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中，northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足地方在于不能准确检测到低表达的miRNA；微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时，费力和标记成本高，检测灵敏度和特异性低等问题。

实时荧光定量技术（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前，用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括miRNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种：同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针（一种适合于扩增短片段的荧光探针），由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA缺点在于合成价格贵，不利于推广。

目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDDmutant using AllGlo^TM probes[J].Clin Chim Acta,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵袭性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。

有研究报道表明，在肿瘤研究方面，hsa-miR-188-5p能够通过抑制一种肿瘤相关蛋白，从而抑制肝细胞癌的侵袭与转移；另一方面在神经系统研究方面，hsa-miR-188-5p能过通过调控神经系统相关蛋白从而影响神经系统形成。（Lee K,Kim JH,Kwon OB,An K,Ryu J,Cho K,et al.An activity-regulated microRNA,miR-188,controls dendritic plasticity and synaptic transmission by downregulating neuropilin-2[J].J Neurosci,2012,32(16):5678-5687）目前hsa-miR-188-5p在生物及其他领域的功能越来越得到重视,使得精确检测hsa-miR-188-5p成为迫切需要。

发明内容