[发明专利]一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法

权利要求书

1.一种检测腐败希瓦氏菌的引物对，其特征在于其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成：

第一引物对为

一条引物的序列为F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQ ID NO.1，另一条的序列为 R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA ，记为SEQ ID NO.2；

或者是第二引物对为

一条引物的序列为F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQ ID NO.3，另一条的序列为R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA       ，记为SEQ ID NO.4。

2.一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，其特征在于包括如下步骤：

a、腐败希瓦氏菌的分离：无菌取鲜活水产样品10g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提细菌DNA；

b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌的基因组DNA，进行PCR扩增，设计的引物序列为：

F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQ ID NO.1，和

R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA    ，记为SEQ ID NO.2；

或者是

F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQ ID NO.3，和

R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA   ，记为SEQ ID NO.4。

3.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：大豆酪蛋白琼脂培养基和铁琼脂平板培养的温度为25℃，培养时间为48h。

4.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：扩增反应体系组分为：PCR Buffer（含Mg²⁺）5μl，2.5 mmol/L dNTP 4μl，20 μmol/L正反引物各l μl，DNA模板1μl，5 U/μl Taq酶 0.5μl，灭菌双蒸水补足至50 μl。

5.根据权利要求2或4所述的分离和检测方法，其特征在于：扩增反应条件： 94℃预变性5 min，变性94℃ 40 s，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，30个循环，终延伸72℃ 5 min。

6.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：所述的铁琼脂平板培养基的组分如下：细菌蛋白胨20 g，牛肉膏3 g，酵母浸出粉3 g，柠檬酸铁0.3 g，硫代硫酸钠0.3 g，NaCl 5 g，L-半胱氨酸0.6 g，琼脂20 g，溶于1 L水中。