[发明专利]一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水产品中腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

养殖鱼类富含营养，消费量逐年增加。然而，水产品组织脆弱，水分和蛋白含量高、组织酶活跃，极易导致鲜度下降及腐败变质。自溶酶、脂肪氧化、外源污染、机械损伤等因素均会引起鱼肉品质劣变，其中微生物生长及代谢形成的胺、硫化物、醛、酮和有机酸等，产生不良气体和风味，是引起腐败的主要原因。然而，由于水产品的种类、加工方式和贮藏条件的差异，水产品中存在不同的微生物构成。在这些微生物菌相中，往往只有一种或几种特定微生物能适合生存和大量繁殖，并产生腐败异味和臭味的代谢产物，称之为特定腐败菌（specific spoilage organism, SSO）。在有氧冷藏条件下水产品的SSO多为腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）或假单胞菌（Pseudomonas spp.）。已发现我国东海产量较高的大黄鱼和带鱼，其冷藏过程中的SSO也是腐败希瓦氏菌。腐败希瓦氏菌为希瓦氏菌属（Shewanella），革兰氏阴性，运动杆菌，嗜冷性，能把氧化三甲胺还原为三甲胺，产H₂S，腐败时出现酸臭味，是水生动物和富含蛋白食品的典型腐败菌。

细菌菌群的鉴定大多依赖传统简便的表现型试验，包括革兰氏染色、生化试验，然而使用这些方法对细菌进行分离和鉴定存在一定的局限性。随着细菌鉴定和分类方法的更新，分子生物学技术是细菌鉴定和特性分析的有效工具，已被成功用于流行病学中的细菌分析。

发明内容

本发明一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，主要用于检测鲜活水产品贮藏过程中特定腐败菌腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的分离和检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种检测腐败希瓦氏菌的引物对，其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成：第一引物对为

一条引物的序列为F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQ ID NO.1，另一条的序列为 R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA    ，记为SEQ ID NO.2；或者是第二引物对为

一条引物的序列为F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQ ID NO.3，另一条的序列为R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA   ，记为SEQ ID NO.4。

一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，包括如下步骤：

a、腐败希瓦氏菌的分离：无菌取鲜活水产样品10g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提DNA；

b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌的基因组DNA，进行PCR扩增，设计的引物序列为：

F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQ ID NO.1，和

R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA，记为SEQ ID NO.2；

或者是

F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQ ID NO.3，和

R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为SEQ ID NO.4。

本发明所指的水产品包括鲜活、冷藏的鱼类、甲壳类、软体动物等。本发明根据腐败希瓦氏菌产H₂S的特性，先用TSA琼脂进行分离，再用铁琼脂纯化，（TSA更适合分离），采用腐败希瓦氏菌的2个特异性引物进行鉴定。特异性引物和扩增的片段大小，见表1。

表 1 引物序列和扩增PCR产物大小

作为优选，大豆酪蛋白琼脂培养基和铁琼脂平板培养的温度为25℃，培养时间为48h。

作为优选，扩增反应体系组分为：PCR Buffer（含Mg²⁺）5μl，2.5 mmol/L dNTP 4μl，20 μmol/L正反引物各l μl，DNA模板1μl，5 U/μl Taq酶 0.5μl，灭菌双蒸水补足至50 μl。

作为优选，扩增反应条件： 94℃预变性5 min，变性94℃ 40 s，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，30个循环，终延伸72℃ 5 min。