[发明专利]一种TALE聚体库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域中的构建方法，特别是涉及一种TALE聚体库的构建方法。

背景技术

TALEN(Transcription Activator-Like（TAL）Effector Nucleases)靶向基因敲除技术是一项崭新的分子生物学工具，是基因功能研究领域的一项重大技术突破。该技术利用TAL序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，可以实现在特异的位点打断目标基因，从而敲除该基因。

TALE蛋白N端和C端分别是核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)和转录激活结构域(Activation domain,AD),而中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列，其序列重复的部分由长度为33～35个氨基酸残基的重复单位(或称重复单元)构成,在每个重复单位中,+12和+13位的氨基酸残基是实现靶向识别特异DNA碱基的关键位点,随靶点核苷酸序列的不同而异，被称作重复可变双残基(Repeat variable di-residue，RVD)；其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的RVD能够相对特异地分别识别A、T、C、G4种碱基中的一种，其中分别与这4种碱基相对应的最常见的5种RVD分别是NI(Asn Ile)、NG(Asn Gly)、HD(His Asp)、NN(Asn Asn)和NH(Asn His)。这5种常见的可变区能分别特异性结合4种不同的碱基（NG识别T,HD识别C,NI识别A,NN和NH识别G）。

由于TALE由大量重复的序列构成，然而，为了保证TALE蛋白识别DNA序列的特异性，人工构建的TALE蛋白DNA结合结构域通常需要含有10个以上的重复单元，总长度大于1000bp。因此，TALE串联重复序列的构建难度较大，成为TALE应用中的主要瓶颈。目前，构建TALE串联重复序列及TALE蛋白DNA结合结构域的主要方法包括人工合成全长的TALE序列，以及基于Golden Gate的载体克隆技术等两种方法。但是上述两种方法构建载体比较慢，不利于高通量的TALE相关载体构建，不利于大规模的基因编辑。因此建立TALE重复区的高效组装技术平台非常重要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，建立TALE重复区的高效组装技术。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种TALE聚体库的构建方法，包括如下步骤：

（1）TALE单体扩增：分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板，使用引物对TALE-Fn/TALE-Rn进行扩增，分别得到第一类至第十五类单体的混合物和第十六类单体N16，其中，所述n为1至16；

（2）构建酶切连接产物：分别将所述第一类至第十五类单体进行进行酶切和连接，得到第一至第八酶切连接产物；

（3）酶切连接产物和第十六类单体N16扩增：分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类至第六类五聚体混合物、三聚体混合物、二聚体混合物和N16扩增产物；

（4）TALE聚体克隆：分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物以及三聚体、二聚体混合物和第十六类单体N16扩增产物，与pDonr221载体（Kana+）进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序；

（5）TALE聚体库构建：根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。

优选的，所述TALE单体扩增包括如下步骤：

分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板，

使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即NI1，NG1，NH1和HD1；

使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2和HD2；

使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3和HD3；

使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4和HD4；