[发明专利]含有树状分子染料的寡核苷酸探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明一般地涉及用于生物检测和生物样品分析的探针。更具体地，本发明涉及以可用于检测和分析生物样品的树状分子染料为特征的寡核苷酸探针，并涉及其组合物及方法。

背景技术

自1980年代以来，荧光原位杂交(FISH)已经发展成为用于生物学研究和医学的一种强有力的工具。FISH是一种细胞遗传学技术，用于检测和定位特定DNA序列在染色体上的有无(Langer-Safer,et al.1982Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79(14):4381–5.)。联合使用荧光探针和荧光显微镜在细胞、循环肿瘤细胞和组织样品中鉴定DNA的特定特征，或检测和定位特定的RNA(mRNA,lncRNA和miRNA)靶标(Amann,et al.2008Nature Reviews Microbiology6:339-348.)。FISH是一种重要的用于疾病例如癌症的辅助诊断和预后的技术。

荧光探针已经成为分析基因、组织和细胞的强有力工具(Waggoner1986Applications of Fluorescent in the Biomedical Sciences,Eds.Taylor et al.,New York:Alan R.Liss,Inc.pp.3-28;Mason,editor1993Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity,Biological Techniques Series,edited by Sattelle,Academic Press Limited,London.)。通常被标记的生物分子包括核苷酸、寡核苷酸、核酸、氨基酸、肽和多肽、蛋白质、糖和脂质，以及其他(Singer&Ward,1982Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79:7331-7335;Singer et al.1986BioTecbniques4:230-250;Pitta et al.1990Strategies3:33;Southern,1975J.Mol.Biol.98:503-517;Alwine et al.1977Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5350-5354;Callow et al.2000Grenome Res.10:2027-2029.)。

先前的荧光团标记方法使用NTP(核苷三磷酸)染料进行标记(见例如WO2000/06773)。另一种荧光标记技术使用铂化合物标记核酸(见例如EP1373572Bl)。基于铂的标记化合物通过铂(II)金属中心与靶生物分子上的氮或硫原子的配位(coordination)而附着在靶生物分子上。这些策略的缺点包括只有有限数目的染料可以被引入到探针中，从而限制了探针的“亮度”(brightness)。此外，NTP染料会由于高度修饰的三磷酸难以掺入(poor incorporation)而导致产量低，并且基于铂的化合物可能导致探针的降解。而且，这两种策略都会造成包括碱基对区在内的整条链的碱基修饰，这会对杂交产生不良影响。

因此，仍然需要新型荧光探针和荧光团标记方法学来解决现有的荧光探针和方法的缺点。

发明内容

本发明部分地基于意外地发现了缀合有树状分子染料、可用于检测和分析生物样品的新型寡核苷酸探针。

这些独特的探针提供了许多优点，同时克服了现有荧光探针的缺陷。首先，可以掺入探针内的荧光染料的量不受限制。其次，已知树状分子染料比它们相应的单独个体更加明亮，导致探针更加灵敏(见例如US2012256102Al)。第三，点击化学的应用一般可导致定量或接近定量的标记。而且，因为含有染料的部分将会位于FISH探针的5'侧，所以荧光部分不会影响探针与靶种类例如基因组DNA或RNA的杂交。

在一个方面中，本发明一般性地涉及寡核苷酸探针。该寡核苷酸探针包括一个(或多个)能够与一个(或多个)感兴趣的靶核酸杂交的核酸序列；和一个(或多个)共价联接于该寡核苷酸的引物，其中该引物共价联接于包含两个或更多个荧光部分的树状分子基团(dendrimeric group)。