[发明专利]一种新型双启动子结构单元

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种新型双启动子结构单元。

背景技术

在整个生物制药行业中，约有70％蛋白药物是由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞表达的。目前市场上广泛应用的CHO细胞表达系统主要有美国Life Technologies公司的DG44细胞表达系统和英国Lonza公司的CHO K1表达系统。

DG44细胞表达系统/CHO K1细胞表达系统中一个共同的特点就是都使用单拷贝CMV启动子，CMV启动子是属于强启动子，能够高效的驱动外源基因在CHO细胞中的转录。然而，生物制药整个过程中包括原材料，设备昂贵，成本居高不下。各大医药公司越来越重视如何提高蛋白表达水平，进而进一步降低成本。而细胞表达外源蛋白的水平的一个关键因素就是外源蛋白mRNA的转录效率，这就涉及到对启动子的结构进行改造，达到更大的转录效率。

发明内容

本发明目的在于彻底克服从培养基中除去这些重组蛋白同时维持CHO细胞的正常生长及高水平的表达量，最终开发出了一种可用于培养CHO细胞的不含有重组蛋白的化学成分确定的培养基。

本发明公开了一种新型双启动子结构单元，其包含2个核酸序列如SEQ ID NO.2所示的CMV启动子和一段核酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列，该双启动子结构单元在经染色体整合后使得表达系统中目的基因的转录或表达增加。

在一些实施例中，所示双启动子结构单元为SEQ ID NO.3、或与SEQ ID NO.3互补的核苷酸序列。

另一方面，本发明公开了一种真核表达载体，其特征在于所述表达载体包含所述的新型双启动子结构单元。

另一方面，本发明公开了一种真核宿主细胞，其特征在于其包含所述的真核表达载体，该宿主细胞为哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞为CHO、NSO，Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK′HaK、2254-62.2、V79、B14AF28-G3、或CHL细胞。CHO细胞为CHO-K1、CHO-DUKX，CHO-DUKX B1、CHO-DG44、或CHO Pro-5细胞。

另一方面，本发明公开了一种形成经稳定转染的高产真核宿主细胞系的方法，其特征在于具有下列步骤：(a)将所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(C)选择经转染的高产宿主细胞。

另一方面，本发明公开了一种制备重组蛋白药物的方法，包含下列步骤：(a)将所述的新型双启动子结构单元整合至包含目的基因的真核表达载体中；(b)用此表达载体转染真核宿主细胞；(c)选择经转染的高产宿主细胞；(d)在使得该一个或多个目的基因表达的条件下培养该所获得的经转染的高产宿主细胞，(e)收集并纯化目的蛋白质。

另一方面，本发明公开了所述的新型双启动子结构单元在制备药物或药物组合物中的用途。

本发明的启动子结构单元可用在哺乳动物细胞表达载体的构建中，构建好的质粒可以用于哺乳动物细胞的瞬时转染及稳定表达细胞株的构建，本发明的启动子单元比传统CMV启动子有更强的转录效率。

附图说明

图1pOptiVEC质粒图谱；

图2Pcmv，Pcmv-Enhl，Pcmv-HBV333质粒图谱；

图3Pcmv-HBV333，Pcmv-HBV333-Pcmv质粒图谱；

图4Pcmv，Pcmv-Enhl，Pcmv-HBV333质粒Firefly荧光素酶活性检测；

图5Pcmv-HBV333，Pcmv-HBV333-Pcmv质粒Firefly荧光素酶活性检测

图6Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin LC/Pcmv-HBV333-Pcmv-Avastin HC质粒图谱；

图7Pcmv-Avastin LC/Pcmv-Avastin HC质粒图谱；

图8Avastin Western-Blot检测结果；

具体实施方式

在本说明书中所使用的多数词语具有本领域技术人员所理解的这些词的含义。在本说明书中明确定义的词语具有在本发明上下文中作为整体所提供的、并且如本领域技术人员所一般理解的含义。在词语或短语的本领域所理解的定义与该词语或短语的在本说明书中明确发明的定义有矛盾时，以说明书为准。本文所使用的标题仅仅为了方便，并且不理解为以任何方式限制。