[发明专利]一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用

说明书

本发明涉及一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用。本发明通过同源重组技术，在受体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选标记基因，并通过筛选标记筛选获得阳性结果，从而实现原位激活基因的表达。本发明的表达方法可用于原位激活基因的过表达，从而应用于基因的功能研究领域。

技术领域

本发明涉及基因转录调控研究领域，具体涉及一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用。

背景技术

基因的表达调控受到多个层次的调控，包括转录水平和转录后水平，对于编码基因还包括翻译水平和翻译后水平的调控等等。

不同的基因在表达的时候也受到不同形式的调控。在研究基因功能时常通过功能缺失实验（loss of function）和功能获得实验（gain of function）两种方式来实现对基因功能的研究。其中功能缺失实验常用的方式有RNA干扰技术（RNAi Interference，RNAi）等技术实现对靶标基因表达的下调，而功能获得实验常用的方式利用表达载体表达基因的cDNA序列实现基因产物的过表达。

表达载体是一种可以在原核生物和真核生物细胞中外源表达蛋白或者RNA的一种环形双链DNA分子，被广泛应用于研究蛋白、RNA等生物大分子在细胞生命活动中的作用。按照应用的宿主不同可分成原核表达载体和真核表达载体。常见的原核表达载体有pET系列、pQE系统、pGEX系列、pMAL系列等多种。而真核表达载体则根据适用的物种不同分酵母表达载体，植物表达载体和真核哺乳动物载体等多种。

在目前的研究中，研究者通常将基因的cDNA序列克隆到表达载体中进行过表达，实现功能过表达。此种方式已用于外源过表达蛋白编码基因基因和外源表达microRNA等。虽然此种方式已发展成熟，但实际操作过程中经常会遇到很多问题，如不能反内源的应基因表达环境，表达产物不能实现正常定位等等。特别是近年来有关长非编RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）的研究让人们进一步意识到这种表达方式存在的不足。

长非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类存在于细胞中，长度大于200nt且不编码蛋白质产物或者编码不具有功能的蛋白质产物的RNA分子。已有的研究已发现了多种类型的lncRNAs，且lncRNAs可通过参与染色质重塑，染色质高级结构维持等多种方式参与基因表达调控，同时还可参与细胞核内亚核结构的形成等等。

人们发现用传统的表达载体进行lncRNAs的过表达时，过表达的RNA往往不能实现正确的亚细胞定位。这有可能是由于过表达cDNA序列时，过表达的RNA无需经过类似于内源基因的RNA加工（RNA processing）过程，如剪接（splicing）；同时表达成熟的lncRNA也与外源表达的蛋白质不同，其分子上可能不具有特殊的细胞内不同位置的定位信号等等。因此，一种类似内源表达的方式实现对靶基因的过表达对于研究lncRNA的功能具有十分重要的作用。

CCAT1-L是一条在结肠癌中高表达的长非编码RNA。原位杂交实验结果显示CCAT1-L分布在细胞核中，呈点状分布（如图Fig1A），并聚集在其转录位点附近（如图Fig1B）。功能获得实验对于研究CCAT1-L的生物学功能具有十分重要的作用。然而，利用传统的载体过表达lncRNAs的实验结果显示，利用外源载体过表达的CCAT1-L分布在整个细胞中,即在细胞核和细胞浆中都有分布（如图Fig1C）。这说明传统方式过表达的CCAT1-L无法模拟内源RNA的定位情况，即无法正确发挥该RNA的生物学功能。利用此种方式过表达CCAT1-L可能导致获得不正确甚至错误的实验结果。因此，一种可以模拟细胞内源CCAT1-L过表达的实验方法对于研究其功能具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达系统及其应用，尤其是利用基因组编辑技术实现原位激活长非编码RNA基因的表达方法及其应用。