[发明专利]一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种产Kdo₂-lipidA的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为无抗性E.coliW3110△rfaD，其中rfaD发生缺失突变失活。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含pKD46质粒的E.coliW3110，获得突变株E.coliW3110ΔrfaD-Fkan，再化转入pCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pCP20质粒后获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42oC培养去除pCP20质粒，获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

4.权利要求2或多所述的方法，其特征在于所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产Kdo₂-lipidA的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于以权利要求1构建的基因工程菌为生产菌株，采用常规发酵后，对Kdo₂-lipidA进行提取，提取方法为：收集发酵后的菌体，0.1MNaCl溶液洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，取上相，弃沉淀，加入20mL氯仿和20mL1.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer二相体系，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）将Kdo₂-lipidA洗出；所述Bligh-Dyer一相体系成分为氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液体积比为1:2:0.8。