[发明专利]一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产Kdo₂-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用，是一种无抗性的Kdo₂-lipidA大肠杆菌生产菌。

技术背景

Kdo₂-lipidA是体现革兰氏阴性菌毒力的疏水性成分，其可以被宿主免疫细胞表面的TLR4/MD2所识别，是感染宿主的毒力因子。随着人们对其致病机制的深入研究，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、Kdo₂-lipidA和类脂A广泛用于动物免疫实验。Kdo₂-lipidA携带类脂A毒力因子，可以达到刺激细胞相同的反应，但是通过基因工程构建的类脂A结构菌株只能在低温下生长，且生长状况非常差。通过化学降解方法提取类脂A的过程繁琐，成本又高。而LPS具有较多缺点，如分子较大，在反应体系中分散不均一，并且细胞刺激反应前后LPS不易于被检测等。而Kdo₂-lipidA分子较小，分散均一，也易被ESI/MS等方法检测。同时，1μgKdo₂-lipidA相当于10μgLPS所引起的反应，而且同样实验反应的花费也仅为LPS的一半。因此，通过基因工程构建一株可以产Kdo₂-lipidA的大肠杆菌可以解决上述问题。目前，Kdo₂-lipidA的生产菌主要是WBB06菌株。现有菌株的缺点在于：第一、WBB06生长状态较野生型差很多，最终菌体量少；第二、WBB06菌带有氨苄青霉素和四环素抗性标记；第三、WBB06的基因组序列并不清晰，即遗传背景不清楚。本发明是构建了一株不带任何抗性标记，遗传背景很清晰，且生长状况较好的生产Kdo₂-lipidA的大肠杆菌基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种无任何抗性标记，生长状况良好的产Kdo₂-lipidA的新型基因工程菌，以适应大规模生产。

为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coliW3110△rfaD，即WJW00，其中rfaD发生缺失突变失活。

本发明还提供了一种构建上述基因工程菌的方法，将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含pKD46质粒的E.coliW3110，获得突变株E.coliW3110ΔrfaD-Fkan，再化转入pCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pCP20质粒后获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

所述位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42℃培养去除pCP20质粒，获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

SEQINNO.1:

tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt   60

gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg  120

tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat  180

tccgcacgac cagtaccgag attgaagatg ccggaaacgc cattttccag gaaccacaga  240

ttcacatcag ccacgaattc gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag  300

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa  360

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc  420

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct  480