[发明专利]酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法

权利要求书

1.酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，其特征在于，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，其在一个氨基酸位点发生突变，即第305位氨基酸由天冬酰胺替换成了天冬氨酸。

2.一种权利要求1所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）脂肪氧合酶高通量筛选：测定酶活时重组脂肪氧合酶基因工程菌的破碎条件为溶菌酶添加量1.5 mg/mL、溶菌酶处理时间40 min、EDTA-2Na添加量2.0 mmol/L、吐温-60添加量2%、－70℃冷冻37℃融解、冻融3次； 

（2）易错PCR：以野生型鱼腥藻脂肪氧合酶质粒pET-32a-ana-LOX为模板，上游引物为5^’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3^’，下游引物为5^’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3^’，进行易错PCR扩增；易错PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收后，限制性内切酶XhoI和SacI分别对易错PCR扩增产物和质粒pET-32a (+)进行消化、连接，转化至感受态细胞，涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素LB平板，于37℃培养12 h后，对转化子进行阳性克隆子鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，得到突变子；

（3）DNA Shuffling：采用步骤（2）得到的突变子基因为亲本基因，通过DNaseI将亲本基因随机片段化并获取50-100 bp的基因片段，进行无引物PCR，组装形成大片段，最后在亲本基因扩增引物的条件下，扩增出改组基因库；对改组基因库进行XhoI和SacI酶切，并与表达载体pET-32a (+)进行连接，转化至E. coli BL21感受态细胞，涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素的平板，于37℃培养12 h后，对转化子进行筛选与鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，获得酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体；

（4）将步骤（3）得到的脂肪氧合酶突变体的工程菌表达与纯化。

3.根据权利要求2所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中测定酶活的方法为碘化钾-淀粉法。

4.根据权利要求2所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中易错PCR的条件为：改变PCR的反应体系：Mn²⁺浓度为0.01-0.4 mmol/L，Mg²⁺浓度为0.625-2.5 mmol/L，dNTP浓度为0.125-0.25 mmol/L，PCR反应条件：95°C 5 min；然后 95°C 30 sec，55°C 1 min，72°C 10 min，共30个循环；最后72°C 10 min。

5.根据权利要求2所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中感受态细胞为E. coli BL21。

6.根据权利要求2所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，其特征在于，步骤（4）中脂肪氧合酶突变体的工程菌表达与纯化方法为将含有脂肪氧合酶突变体的工程菌接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180 rpm培养14 h；接种量体积比为2%，加入上述LB液体培养基中，37℃，180 rpm 培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加IPTG至100 μg/mL，低温16℃诱导16 h，9000 rpm离心20 min，收集菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，检测上清液酶活，并将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化，透析过夜即可得到纯的脂肪氧合酶突变体，其中磷酸缓冲液组成为50 mM PBS与0.3M NaCl以及质量体积比为0.5％Triton X-100的混合液。