[发明专利]酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

脂肪氧合酶（Lipoxygenase, EC 1.13.11.12, LOX）广泛存在于动植物体内，在藻类、面包酵母、真菌以及氰细菌中均发现它的存在。LOX能专一性催化含1,4-顺，顺-戊二烯双键体系的多不饱和脂肪酸氧化形成具有共轭双键的氢过氧化物，这些氢过氧化物性质活泼，是重要的化学反应中间体，在食品、医药、化工等领域有着广泛的应用前景，尤其在食品加工中具有重要的应用价值，如面粉及其制品品质改良、制备风味化合物、茶叶加工等。尽管人们早已认识到LOX在食品加工中的潜在应用价值，且LOX在自然界中广泛存在，但从自然界中直接获得不仅得率低而且纯化难，获得LOX纯酶的成本很高。因此，通过基因工程菌高效表达，且又经过简单的纯化过程获得高纯度的LOX可以解决上述问题，但微生物脂肪氧合酶自身存在催化活性低、热稳定性较差的缺陷，限制其在食品工业中的广泛应用。通过分子生物学技术对脂肪氧合酶进行分子改造，以期获得酶学性质更适用工业应用的突变酶具有重要的意义。

目前，酶分子改造的策略主要有非理性设计（定向进化）与理性设计的策略。通过理性设计和定向进化改善酶学性质一直是蛋白质工程领域中的一个研究热点。而定向进化技术是改善蛋白质性质最有效的策略之一，是在实验室中模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选），能在短期内获得具有优良性质的突变酶。经检索未见脂肪氧合酶分子定向进化研究的相关文献和专利报道。

 

发明内容

本发明目的是为了克服以上现有技术的缺陷，提供一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO.1所示，其在一个氨基酸位点发生突变，即第305位氨基酸由天冬酰胺替换成了天冬氨酸。

一种以上所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，包含如下步骤：

（1）脂肪氧合酶高通量筛选：测定酶活时重组脂肪氧合酶基因工程菌的破碎条件为溶菌酶添加量1.5 mg/mL、溶菌酶处理时间40 min、EDTA-2Na添加量2.0 mmol/L、吐温-60添加量2%、－70℃冷冻37℃融解、冻融3次； 

（2）易错PCR：以野生型鱼腥藻脂肪氧合酶质粒pET-32a-ana-LOX为模板，上游引物为5^’-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3^’，下游引物为5^’-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3^’，进行易错PCR扩增；易错PCR扩增产物经胶回收试剂盒回收后，限制性内切酶XhoI和SacI分别对易错PCR扩增产物和质粒pET-32a (+)进行消化、连接，转化至感受态细胞，涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素LB平板，于37℃培养12 h后，对转化子进行阳性克隆子鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，得到突变子；

（3）DNA Shuffling：采用步骤（2）得到的突变子基因为亲本基因，通过DNaseI将亲本基因随机片段化并获取50-100 bp的基因片段，进行无引物PCR，组装形成大片段，最后在亲本基因扩增引物的条件下，扩增出改组基因库；对改组基因库进行XhoI和SacI酶切，并与表达载体pET-32a (+)进行连接，转化至E. coli BL21感受态细胞，涂布于含100 μg/mL的氨苄青霉素的平板，于37℃培养12 h后，对转化子进行筛选与鉴定，挑选突变子转移至96孔板中诱导表达，并基于96微孔板高通量筛选模型对突变子进行筛选并测序，再经过摇瓶复筛，获得酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体；

（4）将步骤（3）得到的脂肪氧合酶突变体的工程菌表达与纯化。

所述的酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体的制备方法，步骤（1）中测定酶活的方法可以为碘化钾-淀粉法。