[发明专利]一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法

权利要求书

1.一种牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于，具体操作步骤为：

步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离：根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；

所用的两个单引物序列为：

引物A  5'-TGGCCTAGTGG-3'；

引物B  5'-GAGGAYTTG AACC-3'；

步骤二、生物素标记的探针的制备：根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针；

所设计的生物素标记的探针引物的序列为：

PTSB01 5'-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3'；

PTSB02 5'-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3'；

其中PTSB01进行5’端生物素标记；

步骤三、基因组片段富集库的制备：提取牡丹基因组DNA，然后以限制性内切酶Bsp143I进行基因组酶切，得到基因组酶切片段；同时将两条寡聚核苷酸链退火，形成双链的寡聚核苷酸接头，之后通过T4连接酶将酶切后的基因组片段与接头连接，并以单引物的PCR扩增，进行基因组片段库的富集，得基因组片段，备用；

形成双链的寡聚核苷酸接头的两条寡聚核苷酸链分别为：

Adaptor 1       5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGT-3'；

Adaptor 2        3'-CCCGGCTCCACTAG-5'；

单引物的PCR扩增进行基因组片段库的富集，所用引物为：

Adapcr     5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；

步骤四、目的片段的筛选、扩增与测序：将生物素标记的探针与步骤三中所得基因组片段杂交，通过MagneSphere磁珠筛选出目的片段；将筛选出的片段进行接头PCR，将反应产物进行克隆及阳性菌筛选以后，进行测序和序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子序列。

2.如权利要求1所述的牡丹SINE类反转录转座子序列的分离方法，其特征在于：步骤一中所述的用两个单引物进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：

引物A的PCR反应体系为：在PCR管中配制50μL的反应液II，其成分为：8 μL的基因组DNA、6μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR缓冲液、2.5 μL的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq DNA聚合酶、2.5μL的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；A-PCR反应程序为：将配好的PCR反应液II放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，43℃退火1 min，72℃延伸2 min，进行34个循环；72℃终延伸8 min；

引物B的PCR反应体系为：在PCR管中配制20 μL的反应液I，其成分为：8 μL的基因组DNA、5μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR缓冲液、2μL的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq DNA聚合酶、2.5 μL的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；B-PCR反应程序为：将配好的PCR反应液I放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，44℃退火45 s，72℃延伸1 min，进行32个循环；72℃终延伸10 min。