[发明专利]一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种转录转座子序列的分离方法，具体的说是一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法。

背景技术

牡丹是我国的传统名花，观赏栽培历史悠久，唐、明、清三朝牡丹皆为国花，身价之高，无与伦比，被尊为“花中之王”。时至今日，在我国冰天雪地的北方、风和日丽的江南，甚至在温暖炎热的南方，都能欣赏到牡丹，极具观赏价值。各地的牡丹展览、牡丹花会、牡丹书画、牡丹摄影等牡丹主题的活动带来很高的经济效益。对牡丹进行遗传多样性分析、构建核心种质、种植资源分类鉴定等方面得到广泛应用，并取得了显著成果，对加快牡丹育种、提高育种效率具有重要意义。

反转录转座子是散布于基因组中的中度重复序列，由于它的的转座作用以及它与其LTR之间的同源重组导致的基因组的多样性，在真核生物基因组中反转录转座子是核 DNA的主要组分（占核DNA量的50%，部分禾本科植物甚至达到80%）。非LTR类反转录转座子在植物基因组中广泛存在并扮演极其重要的角色，正越来越受到人们的关注。SINE类反转录转座子结构简单，短小且易于改造，具有很好的应用前景。其具有广泛存在、高拷贝数、高异质性，插入位点不可逆等特点，对基因组的大小、结构、功能和进化都具有重要的作用，近年来成为基因克隆、基因表达及其功能、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具。由于以上特性，使植物的反转录转座子很容易作为一种分子标记，应用于遗传变异的研究中。

发明内容

本发明提供一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法，采用磁珠探针复合物的方法来分离SINE类反转录转座子序列，分离出的牡丹SINE类反转录转座子序列，为以后开发基于牡丹SINE类反转录转座子的分子标记提供基础。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种牡丹SINE类转录转座子序列的分离方法，其具体操作步骤为：

步骤一、牡丹SINE类反转录转座子的部分序列的分离：根据真核生物SINE类反转录转座子的保守序列Box A和Box B区域，以两个单引物分别进行PCR扩增，将两次PCR扩增出的产物，进行克隆及阳性菌筛选以后，测序，进行序列分析，得到牡丹SINE类反转录转座子的部分序列；

所用的两个单引物序列为：

引物A  5'-TGGCCTAGTGG-3'；

引物B  5'-GAGGAYTTG AACC-3'；

所述的用两个单引物进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：

引物A的PCR反应体系为：在PCR管中配制50μL的反应液II，其成分为：8 μL的基因组DNA、6μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR缓冲液、2.5 μL的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq DNA聚合酶、2.5μL的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；A-PCR反应程序为：将配好的PCR反应液II放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，43℃退火1 min，72℃延伸2 min，进行34个循环；72℃终延伸8 min；

引物B的PCR反应体系为：在PCR管中配制20 μL的反应液I，其成分为：8 μL的基因组DNA、5μL的含Mg²⁺的溶液、4μL的PCR缓冲液、2μL的磷酸脱氧核糖核苷酸溶液、0.4μL的Taq DNA聚合酶、2.5 μL的PCR引物，余量为灭菌双蒸水；B-PCR反应程序为：将配好的PCR反应液I放入PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，44℃退火45 s，72℃延伸1 min，进行32个循环；72℃终延伸10 min。

步骤二、生物素标记的探针的制备：根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列设计5’端生物素标记的探针引物，以质粒DNA为模板进行PCR，得到生物素标记的探针；具体操作步骤如下：

（1）根据步骤一中所得到的牡丹SINE类反转录转座子的部分序列，设计引物，引物序列（其基因序列如基因序列表序列3和序列4）为：

PTSB01  5'-TAGTGGTGTCTAAGGATTTTGTGAG-3'；

PTSB02  5'-AATCCTGTTCAGCATTCCCGTA-3'；

其中PTSB01进行5’端生物素标记；