[发明专利]一种牡丹基因组DNA分子标记方法

权利要求书

1.一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：其具体操作步骤为：

步骤一、提取牡丹基因组DNA；

步骤二、牡丹基因组DNA的酶切：用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物；

步骤三、酶切产物和接头DNA连接：将所得基因组DNA酶切产物、Mse I接头引物、EcoR I接头引物、T4 DNA连接酶和稀释10倍后的连接缓冲液混合均匀后在温度为16℃的条件下保温30min，得到连接产物；

所述的Mse I接头引物序列包括Mse I 5'端接头引物和Mse I 3'端接头引物，其碱基序列如序列表序列1和序列2；

所述的EcoR I接头引物序列包括EcoR I 5'端接头引物和EcoR I 3'端接头引物，其碱基序列如序列表序列3和序列4；

步骤四、连接产物的预扩增：

（1）、取上述步骤三所得部分连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20μmol/L的Mse I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到Mse I预扩增产物；

（2）、取上述步骤三所得剩余连接产物，将其与用双蒸水稀释10倍后的Buffer、含Mg²⁺的溶液、dNTPs、用双蒸水稀释至20μmol/L的EcoR I预扩增引物、Taq酶和双蒸水混合后，进行PCR扩增，得到EcoR I预扩增产物；

所述的Mse I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列5；所述EcoR I预扩增引物，其碱基序列如序列表序列6；

步骤五、选择性扩增：取上述步骤四得到的Mse I预扩增产物和EcoR I预扩增产物，分别用双蒸水稀释20-40倍后，将其与用双蒸水稀释至20μmol/L的内切酶接头选择性扩增引物、用双蒸水稀释至20μmol/L的iPBS引物、Taq酶、dNTPs、稀释10倍后的缓冲液和双蒸水混合均匀后，进行PCR扩增，得PCR选择性扩增产物；

所述内切酶接头选择性扩增引物为碱基序列如序列表序列7、序列8和序列9的Mse I选择性扩增引物中的任意一条，或者碱基序列如序列表序列10和序列11的EcoR I选择性扩增引物中的任意一条；

所述的iPBS引物为碱基序列如基因序列表序列12至序列52中引物的任意一条；

步骤六、将所得PCR选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果。

2.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：所述步骤二中基因组DNA酶切体系总量为20μL，包括浓度为50ng/μL基因组DNA5-10μL，稀释10倍后的缓冲液4 2.0μL，稀释100倍后的牛血清蛋白 0.2μL，Mse I酶0.5μL，EcoR I酶0.5μL，余量为双蒸水。

3.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：所述步骤三的操作方法为：在微量PCR离心管中，加入基因组DNA酶切产物8μL，Mse I接头引物2.5μL、EcoR I接头引物2.5μL、T4 DNA连接酶1μL、稀释10倍后的连接缓冲液 2.5μL，之后用双蒸水补齐至25μL；用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16℃的条件下保温30min，得到连接产物。

4.如权利要求1所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：所述步骤四的操作方法为：在微量PCR离心管中，加入连接产物2.5μL，稀释10倍后的缓冲液 2.5μL，含Mg²⁺的溶液 1.875μL、dNTPs 0.5μL、Mse I预扩增引物0.5μL、EcoR I预扩增引物0.5μL、Taq酶0.2μL，之后用双蒸水补齐至25μL，置于PCR仪中，进行PCR预扩增。

5.如权利要求4所述的牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：所述的PCR预扩增，具体PCR程序为94℃ 1min；50℃ 90s， 72℃ 90s，36 个循环；72℃ 10min。