[发明专利]一种牡丹基因组DNA分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子标记法，具体的说是一种牡丹基因组DNA分子标记方法。

背景技术

牡丹（Paeonia Suffruticosa Andr.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia  L.） 牡丹组（Sect. Mouton DC.）落叶灌木，是重要的观赏绿化植物和资源植物，其花大形美、色艳香浓，为历代人们所称颂，是我国著名的传统名花，在中国已有2000余年的栽培应用历史。我国牡丹在长期的栽培驯化过程中，形成了以中原、西北、江南和西南等品种群为代表的，具有不同花瓣颜色、数目、花型和叶型的栽培品种1000多个，栽培区域遍及全国各地。牡丹组共有9个种，（洪德元和潘开玉，1999；Hong和Pan,2007），分布于河南、甘肃、陕西、山西、安徽、湖北、四川、云南和西藏等9个省区。

其它作物上的研究表明反转录转座子与基因组的进化，性状的变异等密切相关。已有研究表明反转录转座子是植物基因组进化的主要动力，借助于反转录转座子可以准确获得种质间的进化关系。牡丹种质资源遗传多样性丰富，遗传变异大，但对于种质间的进化关系还未了解清楚。

分子标记技术可从 DNA 水平上检测生物体的遗传多样性，不受基因表达和环境条件的影响，其操作简单快速，易实现自动化，广泛应用于植物遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位、分子标记辅助育种等方面。目前应用较多的分子标记技术主要有RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP等。反转录转座子分子标记较传统的分子标记具有诸多优势，其检测的多态性信息含量明显高于传统分子标记。近年来，随着研究的逐渐深入，基于反转录转座子的分子标记方法也在增加，其中最常用的主要是SSAP、IRAP、REMAP、RBIP四种，已广泛用于植物种质资源及遗传育种研究。基于反转录转座子的分子标记与常规分子标记技术比较，反转录转座子最大的优势在于它能覆盖全基因组，提供的信息更丰富，可作为高通量标记分析，具有很大的发展潜力。与RFLP、RAPD、SSR和AFLP等常规DNA标记检测多态性不同，基于反转录转座子的标记技术的多态性来源于其结构、组成、分布和逆转座的生物学过程。

反转录转座子分子标记是目前应用广泛的分子标记技术，已被应用于大麦、玉米、小麦、苹果、葡萄等多种植物。利用反转录转座子分子标记不仅可以有效地进行体细胞克隆变异的鉴定，还可以有效地进行遗传作图和农艺性状基因的标记，用于生物多样性和系统进化关系分析。其中，SSAP(Sequence-specific amplification polymorphism)是一种可以检测反转录转座子和与其邻近的酶切位点之间DNA片段扩增多态性的反转录转座子分子标记。其原理和操作流程类似于AFLP，只是在进行选择性扩增时除了一个能与接头同源配对的引物外，另一个引物根据反转录转座子的LTR（长末端重复序列）末端保守序列来设计。SSAP由限制性内切酶消化基因组DNA，然后连接接头，再分别进行预扩增和选择性扩增，通过同一位置片段的有无来判断其多态性。多态性来源于限制性位点及其两侧序列的变异，这点与AFLP相同，而LTR5'末端和反转录转座子插入位点的变异所产生的多态性是AFLP所没有的，因此SSAP标记方法不仅可以检测插入位点的多态性，又可识别反转录转座子内部变异，但其实施是建立在反转录转座子两端LTR序列分离的基础上。若想开展此类标记，必须先得到反转录转座子LTR序列，而目前分离LTR序列方法的效率还较低。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其为牡丹的种质资源遗传变异和进化研究提供新的技术手段而且更加简单、高效，实用，大大简化了试验程序，大大的降低了应用难度。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种牡丹基因组DNA分子标记方法，其特征在于：其具体操作步骤为：

步骤一、提取牡丹基因组DNA；

步骤二、牡丹基因组DNA的酶切：用限制性内切酶Mse I和限制性内切酶EcoR I对上述步骤一所提取的基因组DNA进行酶切，得到基因组DNA酶切产物；

所述基因组DNA酶切的酶切体系为20μL，包括浓度为50ng/μL基因组DNA5-10μL，稀释10倍后的缓冲液4 2.0μL，稀释100倍后的牛血清蛋白 0.2μL，Mse I酶0.5μL，EcoR I酶0.5μL，余量为双蒸水。