[发明专利]一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及包括，用于检测艰难梭菌（Clostridium difficile）菌株或有毒艰难梭菌菌株的试剂盒，及检测鉴定样品中的艰难梭菌有无及毒素分型的方法。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰阳性产芽孢厌氧杆菌。艰难梭菌本身没有侵袭性，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性假膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection,CDI）。医院获得感染性腹泻所明确的病原中，以艰难梭菌最为常见；在抗生素相关性腹泻病因中，艰难梭菌亦占20%～30%；而假膜性肠炎则几乎100%由艰难梭菌所致。在美国，艰难梭菌感染是引起医院感染性腹泻的第一位原因。

尽管长期以来一直将这种微生物当作一种能引起严重后果的不常见感染的病原菌，但最近几年，艰难梭菌感染的特征已发生了变化。过去五年来，有很多关于艰难梭菌导致的疾病发生率、疾病的严重程度以及致死率等增加的报道。这种流行病学的改变与出现了一种新的高毒力的艰难梭菌菌株有关，这种菌株被称为艰难梭菌NAP1（North American pulsed-field type1）、PCR核糖型027（polymerase chain reaction ribotype027）流行菌株，该菌株拥有以前常见艰难梭菌所没有的一些特征，如毒素TcdA和TcdB的产生量增加，携带产生第三种毒素，又叫二元毒素（binary toxin）的基因，并出现tcd C基因中18个碱基对缺失。对喹诺酮类抗生素的耐药性增加。由于NAPI／027菌株毒素A、B的产量分别较普通菌株高16倍及23倍，因此引起严重的艰难梭菌相关性疾病。

艰难梭菌检测有直接粪便毒素测定包括细胞毒素测定（CTA）、酶免疫测定以及。CTA中毒素B的检测被认为是艰难梭菌检测的金标准。但该试验需要48～72h，并且实验条件要求较高，其结果的可靠性在不同的实验室之间变化也很大。

荧光定量检测的方法检测因其快速、灵敏逐渐成为艰难梭菌检测的主流检测技术。初步统计，美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）认证的定量检测产品有BD公司的Gene-Ohm检测系统，Gen-Probe公司的proGastro检测系统，Cepheid公司的Xpert检测系统，Great Basin公司的Portrait检测系统，Focus DX公司的Simplexa检测系统。这些检测系统除Xpert都只检测艰难梭菌毒素B（tcd B）基因。并且Cepheid公司的Xpert检测系统同时检测毒素B（tcdB）,tcdC基因缺失（tcd C deletion），二元毒素（Binary Toxin）。

中国专利申请201310108285.6提供的方案在检测单基因时灵敏度可以做到1个拷贝，但是没有给出如何进行多重PCR扩增的技术启示。

中国专利申请201310316848.0提供的检测系统可同时检测四个基因座，艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB），灵敏度最低为3pg/μl。可见复扩的定量PCR灵敏度比单重检测的要低。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可以同时检测艰难梭菌菌种特异性的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B（tcd B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的复合扩增试剂盒，需要其具有分型准确、检测限低的优点。

技术方案：

一种荧光标记多重PCR艰难梭菌检测试剂盒，包括有用于扩增艰难梭菌的磷酸丙糖异构酶（triosephosphate-isomerase，tpi）基因、毒素A基因（tcdA）、毒素B基因（tcd B）、tcdC基因（tcdC）、二元毒素A基因（cdtA）和二元毒素B基因（cdtB）所对应的引物。