[发明专利]一种实时FRET-PCR和巢式PCR检测和分型立克次氏体的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明建立了一套基于柠檬酸合成酶基因、可以对所有立克次氏体的种进行检测和分型的系统。本系统通过实时FRET-PCR和巢式PCR相结合的方式而达到快速检测和分型所有立克次氏体种的目的。

背景技术

立克次氏体是一种细菌，但同时具有病毒的特征，是严格的细胞内寄生生物，寄生在各种吸血节肢动物和昆虫体内。人和动物通过被感染立克次氏体的媒介昆虫叮咬或接触其粪便而感染，可引起人类和动物发热、头痛和皮疹等临床症状。该病多发生在热带与亚热带国家和地区，目前立克次氏体感染已成为世界性问题。目前我国已将流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒等由立克次氏体感染所引起的传染病列为乙类传染病。我国存在10种以上立克次氏体感染引起的疾病，如流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、恙虫病、北亚蜱传斑点热、黑龙江蜱传斑点热、内蒙古蜱传斑点热、Q热、人单核细胞埃立克体病、人粒细胞埃立克体病以及巴尔通体病等。立克次氏体严格细胞内寄生性决定了鉴定立克次氏体感染不同于传统的细菌学诊断，如不易于分离和培养。立克次氏体在世界范围内检出率不高且阳性样品中立克次氏体核酸含量相对较低，亟需一种高效和高灵敏度的检测方法。

1.分离培养。对于细菌性感染，从发病机体内分离和培养病原体是测定其种属的常用方法。立克次氏体是一类介于细菌和病毒之间，更接近于细菌的原核生物。目前分离培养立克次氏体的常用方法有：（1）细胞培养。是目前临床标本初步分离立克次氏体使用最广泛的方法，最常用的细胞系有L929及vero细胞。（2）动物接种法。用于初代分离，常用实验动物有小白鼠、豚鼠、大白鼠、地鼠等。（3）鸡胚卵黄囊培养法。作为动物培养的辅助方法，用于动物培养失败的弱毒株和无毒株培养，也可用于病原体在动物体内的传代接种，它能直接从现场标本中分离病原体。由于立克次氏体为严格的细胞内寄生，同时感染的人或动物菌血症时间较短且病原菌含量很低，使得立克次氏体的分离培养较为困难。

2.血清学。立克次氏体特异抗体的检测是WHO推荐的主要诊断技术之一，然而血清抗体一般在发病5到10天能够检测到，主要是IgM型抗体。单份血清特异抗体明显高于当地正常人群血清滴度或双份血清发生血清转换（血清抗体4倍升高）可进行明确诊断。血清学方法通常根据实验目的、实验条件进行。通用的国际标准是间接免疫荧光（IFA）检测血清抗体。（1）间接免疫荧光（IFA）。主要采用立克次氏体特异抗原检测感染人或动物血清抗体，且同一抗原片可以同时检测多种立克次氏体。（2）补体结合试验（CF）。是一种有补体参与并以绵羊红细胞和溶血素为指标系统的免疫检测方法。（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）。包被抗原通常为重组抗原，可用于急性病例诊断和流行病学调查。由于立克次氏体较难分离培养，使得试剂盒中抗原提纯不足而使结果中经常出现假阳性或交叉感染。

3.免疫组化。免疫组化荧光检测立克次氏体能在血清转化前诊断病人或动物的感染。新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋的标本均可用于免疫检测，在普通显微镜下观察到细胞周围感染的立克次氏体具有较高的灵敏性和特异性，尤其在没有荧光显微镜的实验室更加方便。但此方法专业性较强，且操作繁琐。

4.分子生物学。以PCR扩增及测序为主要手段的分子生物学技术目前已取代病原分离作为直接诊断依据。PCR技术包括常规PCR、巢式PCR和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）。（1）常规PCR。通常选用属、群或种特异基因进行扩增。如立克次氏体属16SrRNA，斑疹伤寒和斑点热群17KD、gltA和外膜蛋白ompB等。（2）巢式PCR。如17KD、gltA、ompB、56KD巢式PCR分别被用来检测斑疹伤寒群和斑点热群、恙虫病立克次氏体。（3）实时荧光定量PCR。这是目前检测病原体最快速、准确、特异、灵敏的核酸检测技术。如根据gltA基因序列设计引物和探针建立了斑疹伤寒和斑点热群立克次氏体的荧光定量PCR检测技术。然而，目前的分子诊断方法还不够成熟。部分通过传统PCR和琼脂糖凝胶电泳的检测方法可以涵盖所有的立克次氏体种属，但是操作繁琐，不适应于大量样本的检测。现存的定量PCR仅能检测立克次氏体的部分种，而且不能区分有致病性差异的不同种立克次氏体。

发明内容

1.要解决的技术问题