[发明专利]烟草鲨烯环氧酶蛋白、烟草鲨烯环氧酶基因及其应用

权利要求书

1.利用烟草鲨烯环氧酶基因培育甾醇含量减低的转基因烟草的方法，其特征在于，通过构建载有烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体，并转化烟草，获得甾醇含量减低的转基因烟草；所述烟草鲨烯环氧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，具体包括以下步骤：

(1)设计引物序列如下：

NT-SS-F，5ˊ-ATGGTACCGATGTACTGGTCAAAAAGTGCCT-3ˊ，

NT-SS-R，5ˊ-CACTCGAGTCAGCCGGGCTCCAATCCAC-3ˊ；

PCR扩增烟草鲨烯环氧酶基因中第629位至第1127位核苷酸序列，共499bp片段，

(2)将步骤(1)中扩增片段插入VIGS载体中，构建TRV-NtSE载体；

(3)烟草种子播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵中，于22℃，16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理；

(4)生长4-5w，选取长势一致将含有TRV1、TRV2、TRV2-SS农杆菌单菌落接入YEB培养基中，1L YEB培养基组成为5g牛肉浸膏、5g细菌蛋白胨、5g蔗糖、1g酵母抽提物、2ml 1M硫酸镁，高温高压灭菌，28℃、250r/min过夜振荡培养至OD为1.0；

(5)测OD值，计算亚培养需要的菌液体积X值，并吸取X体积的菌液接入50ml YEB中，内含10mmol/L 2-N-吗琳基乙磺酸和20μl/L乙酰丁香酮，即在50ml YEB加入5ml乙酰丁香酮，500ml 2-N-吗琳基乙磺酸，50ml抗生素，28℃过夜振荡培养至OD为0.2-2.0；

(6)测OD值，计算加入的MMA的量Y值，MMA为10mmol/L MgCl₂，10mmol/L 2-N-吗琳基乙磺酸和100mmol/L乙酰丁香酮，调整悬浮液的浓度OD600＝2.0，4000r/min离心8min收集农杆菌到50ml离心管中，倒出上清，向各菌体中加入MMA，再在TRV2、TRV2-SS MMA悬浮液中等体积加入TRV1的MMA悬浮液混匀，室温静止1h后即可接种，挑选长势一致，4-5片叶子的烟草植株，用1ml无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22℃，75％空气湿度中培养。