[发明专利]烟草鲨烯环氧酶蛋白、烟草鲨烯环氧酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及烟草甾醇合成及调控关键基因，特别是涉及烟草鲨烯环氧酶基因NtSE在减低烟草甾醇含量上的应用。

背景技术

烟草是双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物。烟草属(Nicotiana)有60多个种，2个栽培种中普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum) 占据主要面积，黄花烟草(Nicotiana rustica) 的面积很小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。

植物甾醇是烟草中一类重要的化合物，归属于脂类化合物，其基本结构是环戊烷多菲碳架。烟草中主要含有胆固醇，菜籽甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇，麦角甾醇和菜油甾醇也少量存在。研究表明烟草的己烷萃取物（甾醇、三萜等）是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物之一。由于甾醇的结构中都含有羟基，热解时其母体的四轮环戊烯[α]菲环结构可形成稠环芳烃，因此烟草中的甾醇是一种潜在的影响人体健康的物质，所以降低烟草成熟叶片中甾醇含量也是卷烟降焦减害的有效途径之一，目前尚无有效减低烟草中甾醇含量的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于寻找调控烟草甾醇含量的功能基因，进而提供一种降低烟草甾醇含量的方法，为低甾醇烟草育种提供技术手段。

本发明的技术方案是：一种烟草鲨烯环氧酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种烟草鲨烯环氧酶基因，编码权利要求1所述烟草鲨烯环氧酶蛋白的基因。

一种烟草鲨烯环氧酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

所述烟草鲨烯环氧酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID NO：2的第629-1127位核苷酸序列。

所述的烟草鲨烯环氧酶基因在减低烟草甾醇含量中的应用。通过转基因技术或瞬时表达技术干扰、沉默、或敲出所述烟草鲨烯环氧酶，获得甾醇含量减低的烟草转化植株。构建所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导沉默载体或RNAi干涉载体并转化烟草，获得甾醇含量减低的转基因烟草。所述烟草鲨烯环氧酶基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体通过下述方法构建：以所述烟草鲨烯环氧酶蛋白基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中。

对于栽培种烟草鲨烯环氧酶基因NtSE进行了克隆，并利用病毒诱导的基因沉默手段进行功能分析，为优质烟草的基因工程育种提供新的策略和工具。

本发明研究发现，烟草中鲨烯环氧酶基因是烟草甾醇合成途径的关键调控基因，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，在烟草中干扰其表达，获得基因沉默植株，检测发现这些基因沉默植株中甾醇含量相对于对样品含量显著下降。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。

本发明提供的用于减低甾醇含量的基因编码烟草鲨烯环氧酶，来源于烟草（Nicotiana tabacum），命名为NtSE，编码下述蛋白质（i）或（ii）：

（i）序列表中的SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质；

（ii）序列表中的SEQ ID NO：1所示氨基酸学列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺少或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（i）所述蛋白质相同的功能。

序列表中的SEQ ID NO：1序列由531个氨基酸残基组成，其中第5位至第27为氨基酸残基是跨膜结构域，所述取代、缺少或添加的一至十个氨基酸残基可以是上述结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺少或添加，以及对相对功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。

本发明的烟草鲨烯环氧酶SE基因NtSE可以是cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA序列。