[发明专利]一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。 

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。 

目前，杆菌肽大多通过微生物发酵法生产，其主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。杆菌肽发酵过程中，氨基酸底物的供应对其产量具有重要的影响，合理及充分的氨基酸供应可以提高杆菌肽的产量。 

有研究表明某些氨基酸（例如半胱氨酸）的补料对于杆菌肽的产量有促进作用。但是，目前，在杆菌肽微生物发酵生产领域，大多数研究者和厂家采用向发酵培养基中添加半胱氨酸的方式（补料添加方式）来实现杆菌肽生产菌株生长过程中半胱氨酸的供应，从而提高杆菌肽的产量。但是，此通过半胱氨酸补料添加方式提高杆菌肽产量的方式存在诸多缺点：（1）杆菌肽产量依然较低；（2）半胱氨酸添加的量较大时，在培养基中溶解需要一定时间，未完全溶解的半胱氨酸容易沉积，堵塞发酵罐的管道口；（3）人工往培养基中添加半胱氨酸，会打乱生产菌株的正常代谢，影响菌株的生长周期，也容易造成染菌；（4）半胱氨酸的需求添加量由发酵罐中菌的个数决定，而发酵罐中菌量增加迅速，因此，半胱氨酸的加入量难以确定。 

发明内容

本发明旨在提供一种能够高产杆菌肽的携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法与应用。 

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2(pHY300-cysE) [英文名称为：Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE) ]，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：M 2013402，保藏日期为2013年9 月10日。 

一种携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）从原始地衣芽孢杆菌DW2 [英文名称为：B.licheniformis DW2] 的总DNA中扩增出cysE基因（即乙酰转移酶基因）片段；（2）在cysE基因片段上游连接启动子、下游连接终止子，构成完整的表达元件；（3）在表达元件的前、后分别加上EcoR I、Hind III酶切位点，构成目的基因片段；（4）采用EcoR I和Hind III限制性内切酶分别对目的基因片段和质粒pHY300PLK进行酶切，得到1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段；（5）将此1284bp 的cysE片段和4870 bp的线性质粒片段经DNA连接酶连接，得到表达载体pHY300-cysE；（6）将表达载体pHY300-cysE转入B.licheniformis DW2，以四环素抗性或氨苄青霉素抗性为筛选标记，筛选得到携带丝氨酸乙酰转移酶基因的地衣芽孢杆菌DW2[英文名称为：Bacillus licheniformis DW2(pHY300-cysE) ]。 

其中，所述的原始地衣芽孢杆菌DW2[英文名称为：Bacillus licheniformis DW2]，保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。 

所述的启动子优选采用p43启动子，p43启动子为基因工程领域常用的启动子，不仅表达可靠，并且，p43启动子属于组成型启动子，此种类型的启动子不受组织器官和发育阶段的基因表达的影响，适用性强。 

所述的终止子优选采用淀粉酶终止子，淀粉酶终止子的基因序列容易获得。当所述的启动子采用p43启动子，同时，所述的终止子采用淀粉酶终止子时，所得到的完整表达元件为1284bp的基因片段、目的基因片段为1302bp的基因片段。 

在cysE基因片段上游连接p43启动子、下游连接淀粉酶终止子(amy1)均采用重叠延伸PCR进行。当然，采用酶切酶连的方式也可达到同样的效果，但是却容易引起基因移码、表达效率下降等问题。