[发明专利]一种I型和V型胶原蛋白的制备方法

说明书

技术领域

    本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种I型和V型胶原蛋白的制备方法。

技术背景

我国是一个渔业大国，但加工技术水平较低，大量的加工废弃物造成了严重的资源浪费和环境污染。胶原蛋白可广泛应用于食品、化妆品、医药、材料等领域，但近年来疯牛病、口蹄疫、猪链球菌、禽流感等传染病的频繁暴发，使传统畜禽来源胶原蛋白的安全性越来越让人担心；同时，宗教习俗原因也使其应用受到一定的限制。因此，利用水产品加工废弃物生产可以替代畜禽来源的胶原蛋白，对于减少环境污染、提高渔业效益、促进产品安全具有重要意义。

至今，研究人员已经鉴定出了至少29种胶原蛋白（I-XXIX）。I型胶原蛋白在脊椎动物体内含量最多，广泛分布于机体的各个组织，也是当前各领域应用最多的一种。V型胶原蛋白常常伴随着I型胶原蛋白表达，但含量较少，具有其独特的生理功能，如抑制表皮、内皮、平滑肌、癌细胞的粘附和增殖，结合肝素、胰岛素、骨矿化结合素、血管内皮抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子等生物活性物质，可用于医药、材料和生物医学等领域。

近年来，人们从多种水产品加工废弃物（皮、鳞、骨、鳍）中提取出了胶原蛋白粗品，但由于胶原蛋白分子量大，溶液粘度高，各型分子特征又高度相似，所以胶原蛋白的纯化相当困难，也少有文献报道。

发明内容

本发明以水产品加工废弃物（鱼皮）为原料，利用生物酶解和分级盐析的方法分离纯化I型和V型胶原蛋白，应用于食品、医药、化妆品、生物材料等领域。

本发明采用的技术方案：

（1）原料的预处理：

将去除鱼鳞及皮下组织的鱼皮，用自来水清洗，沥干，剪碎（约1 cm²），烘干，粉碎，浸泡于NaOH溶液，搅拌，离心取沉淀，用自来水冲洗后烘干。

（2）胶原蛋白的提取：

将预处理过的鱼皮置于预冷水中，加入乙酸和胃蛋白酶，搅拌后离心取上清液，缓慢加入NaCl粉末至混合液中，盐析过夜，再次离心，所得白色沉淀即为胶原蛋白粗品。

（3）胶原蛋白的纯化：

将上述胶原蛋白粗品充分溶解于含有NaCl的Tris-HCl缓冲液中，离心取上清液，加入NaCl至上清液中，盐析，再次离心，分别收集沉淀和上清液：

A. 将沉淀溶解于乙酸1中，用乙酸2透析后，冷冻干燥，即得I型胶原蛋白。

B. 向上清液中再次加入NaCl至混合液中，盐析，离心取沉淀，同步骤A中I型胶原蛋白操作，溶解，透析，干燥后即得V型胶原蛋白。

其中，步骤（1）中所述烘干条件均为50-60°C；所述粉碎至20-100目；所述粉碎后的鱼皮与NaOH溶液比例为1g:50-100mL，其中NaOH溶液浓度为0.1mol/L；所述搅拌时间为24-36h；所述用自来水洗至pH为6-8；所述离心为2,500 g离心10min。

 其中，步骤（2）中所述乙酸在水中的浓度为0.1-0.5 mol/L，所述胃蛋白酶在水中的质量分数为0.1%；所述搅拌时间为36-48h；所述加入NaCl粉末的混合液中NaCl的浓度为2.0 mol/L；所述搅拌后离心为100,000 g离心60 min，所述再次离心为100,000 g 离心15 min。

其中，步骤（3）中所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.05 mol/L并含有1.0 mol/L NaCl，pH 7.5；所述加入NaCl后的上清液中NaCl浓度为2.4 mol/L；所述离心为100,000 g 离心60 min，所述再次离心为100,000 g 离心15 min。

其中步骤（3）第A步中所述乙酸1浓度为0.1-0.5 mol/L；所述乙酸2浓度为0.01-0.05 mol/L，所述透析时间为48-72h。

其中步骤（3）第B步中所述加入NaCl后的混合液中NaCl浓度为4.0 mol/L；所述离心为100,000 g 离心15 min。

上述技术方案中，所有提取和纯化操作均在4°C下进行。

上述技术方案中所述的鱼皮包括所有用于加工生鱼片、鱼糜制品等的淡水鱼和海水鱼的鱼皮。

此工艺适合批量生产，只需按比例放大即可。

本发明的有益效果：